Efectos sobre el metabolismo lipídico de extractos de olivo ricos en polifenoles

Résumé

Antecedentes. El olivo constituye una fuente de compuestos bioactivos, tanto en su fruto, como en sus subproductos. Los extractos de aceitunas son ricos en polifenoles y no son tóxicos. Algunos de sus compuestos han mostrado beneficios para la salud en modelos celulares y animales. Así, los polifenoles de la oliva presentan actividad antiinflamatoria, previenen la apoptosis por estrés oxidativo, favorecen el neurodesarrollo y neuroprotección y tienen efecto antiadipogénico en diferentes modelos celulares, protegiendo contra el aumento de peso y la acumulación de grasa. Objetivos. Se han planteado los siguientes objetivos: Evaluar la bioseguridad in vitro e in vivo de extractos de huesos de aceituna ricos en polifenoles. Analizar el posible efecto antiadipogénico de los polifenoles del olivo en pez cebra midiendo la ganancia de peso, colesterol, triglicéridos y ácidos grasos. Evaluar la influencia de los extractos de aceituna en los mecanismos de digestión y absorción de polisacáridos y grasas mediante la cuantificación de amilasa, glucosa, fosfolipasa y colesterol en el modelo de pez medaka. Comprobar la actividad antiadipogénica de dichos extractos, utilizando la diferenciación a adipocitos de la línea celular 3T3-L 1 de fibroblastos de ratón. Evaluar el posible efecto de los extractos de oliva ricos en polifenoles sobre el metabolismo de los lípidos en pez medaka cuantificando la expresión de genes lipogénicos y lipolíticos. Material y métodos. Para el primer objetivo, se ha evaluado la citotoxicidad mediante adición de extracto de hueso de olivas disuelto en PBS (0-400 mg/1) a un cultivo de la línea celular THP1-XBlue-CD14 y evaluación de la viabilidad celular mediante la reacción de reducción de la resazurina por las células vivas. La bioseguridad se ha evaluado en pez cebra, incubando huevos fecundados en extracto de O a 100 mg/I durante 24 a 72 horas y midiendo los parámetros: a) letales (embriones muertos, huevos coagulados), b) subletales (movimientos espontáneos, pigmentación, edemas) y c) teratogénicos (malformaciones, retraso desarrollo). Para el segundo objetivo, Se han utilizado huevos fecundados e incubados en placas de pocillos a 26±1 º C durante 72 horas: Grupo control en agua con DMSO al O, 1 %. Grupo intervención, añadiendo extracto polifenólico a 1 00mg/1. Al finalizar la incubación se procedió a la cuantificación en ambos grupos de la masa corporal de las larvas secas, proteínas, colesterol total, triglicéridos y ácidos grasos. Para el cuarto objetivo, se cultivan y diferencian las células 3T3-L 1 de fibroblastos de ratón (6.000 células/pocillo) en presencia del extracto de huesos de aceitunas a 1 O y 50 mg/I de polifenoles, concentraciones bioseguras, y sin extracto como control. A los 5-7 días se forman los adipocitos maduros. Se cuantifican los cúmulos de grasa formados mediante tinción con Oil-Red y medida de la absorbancia a 490 nm y la expression de los genes de leptina y PPARg, relacionándolos con los valores en los cultivos antes y después de diferenciarse a adipocitos. Las muestras control, sin extracto, se consideran el 100% de acumulación de grasas. Por último, para el quinto objetivo, los peces medaka adultos se mantuvieron en tanques durante cinco días con cinco extractos al 0.01 % en agua, causando obesidad a través de una dieta rica en carbohidratos, con un grupo de control mantenido en agua con una dieta normal. Los extractos contenían polifenoles que oscilaban entre 7 y 116 mg/g (oleuropeína, hidroxitirosol) con un poder antioxidante de 2-13 mmol de 2,4,6-tri (2-piridil) -1,3,5-triazina/100 g. Después de cinco días, los peces fueron sacrificados y el ARNm hepático y su ADN complementario se obtuvó mediante transcripción inversa. Los ADN complementarios se cuantificaron para tres genes lipolíticos y tres lipogénicos por PCR en tiempo real. La expresión genética relativa se calculó a partir de la amplificación utilizando curvas en referencia al grupo de control. Resultados. En primer lugar, se analizó la citotoxicidad (efecto tóxico cuando viabilidad inferior al 75%) del extracto de huesos de oliva en la línea celular THP1-XBlue-CD14, está en concentraciones superiores a 50 mg/I de extracto (viabilidad 77,5%), calculando una LD50 (dosis de letalidad 50%) superior a 800 mg/1. La bioseguridad in vivo con los embriones de pez cebra expuestos a concentraciones de extracto de 0-100 mg/I mostró total viabilidad a 24, 48 y 72 horas postfecundación (hpf), no observándose mortalidad ni se apreciaron embriones con efectos subletales, teratógenos, ni adelanto o retraso en la eclosión. Los valores de peso de los peces analizados no muestran diferencias entre control e intervención, igualmente todos los demás parámetros analizados, proteínas, cholesterol total, triglicéridos y ácidos grasos, no han presentado diferencias significativas con la introducción del extracto durante la incubación. Estos resultados no son concluyentes debido posiblemente a que no se ha tenido en cuenta que el tejido adiposo aparece en el pez cebra a las 120 horas postfertilización. Se deben realizar nuevos ensayos con el fin de confirmar o descartar el efecto sobre diferentes parámetros relacionados con el metabolismo lipídico, ensayos que tengan en cuenta las condiciones fisiológicas normales del modelo animal escogido. Los extractos de polifenoles no fueron tóxicos en los peces medaka a una concentración de 0.1 %, diez veces mayor que la concentración utilizada. Se observó una disminución general en los niveles de glucosa en peces sobrealimentados con carbohidratos con la adición de extractos, pero sin volver a los niveles del grupo control con alimentación estándar (disminución entre 15-40%). No hubo impacto sobre la amilasa en adultos o alevines, se observó una disminución general pero no significativa del colesterol y un aumento general de la fosfolipasa en los alevines. En la línea cellular 3T3-L 1 de fibroblastos de ratón, la adición de 50 mg/I de extracto de polifenoles de huesos de aceituna muestra un cúmulo de grasa de alrededor del 50%, semejante a las células no diferenciadas. Con 1 O mg/I de extracto no se muestra efecto. Se confirma la actividad antiadipogénica, observándose disminución en la expresión de los genes PPARg y de leptina en la diferenciación a adipocitos en presencia del extracto a 50 mg/1. La expresión de genes implicados en la lipólisis, incluyendo el receptor activado para la proliferación de peroxisomas, acil-CoA oxidasa 1 y carnitina palmitoiltransferasa 1, se redujeron claramente en los peces sometidos a una dieta obesogénica, y esta situación no se invierte con la adición de los extractos ricos en polifenoles. En contraste, los genes implicados en la lipogenesis, genes de la ácido graso sintasa, acetil-CoA carboxilasa 1 y de la proteína 1 de unión a elementos reguladores de esteroles aumentaron considerablemente con la dieta obesogénica y volvió al estado normal con los extractos de aceituna. Este efecto no fue dependiente del contenido total de polifenoles, la concentración específica de oleuropeína o hidroxitirosol, o el poder antioxidante, lo que sugiere un efecto sinérgico. Conclusiones. Se puede concluir que el extracto de huesos de olivas es altamente bioseguro hasta al menos concentraciones de 100 mg/1. Los extractos de aceitunas ricos en polifenoles reducen los niveles de glucosa en peces sobrealimentados. La formación de los cuerpos grasos característicos de la adipogénesis en la diferenciación de los fibroblastos 3T3-L 1 queda inhibida previa adición de 50 mg/I de polifenoles de extracto de huesos de aceituna, así como la expresión de los genes adipogénicos PPARg y de leptina. Por último, los polifenoles del olivo actúan como agentes antilipogénicos, tienen un efecto positivo en el metabolismo de los lípidos, pero su mecanismo en la expression de cada gen es diferente en relación a cada extracto utilizado, lo que apoya la presencia de mecanismos sinérgicos respecto a las diferentes proporciones de polifenoles y fitoquímicos acompañantes en cada extracto.