Variables condicionantes en el cribado neonatal de fibrosis quística mediante tripsina inmunorreactiva

Resumen

1.-INTRODUCCIÓN La FQ es una enfermedad hereditaria AR, causada por mutaciones en el gen CFTR.El gen está situado en el brazo largo del Cr. 7 y se compone de dos alelos situados en los loci (7q3.1).El gen CFTR está compuesto por 27 exones. Este gen codifica una proteína reguladora de conductancia transmembrana (CFTR), entre cuyas funciones están: acción sobre canales de sodio, clor, acuaporina, bicarbonato, equilibrio del agua¿ Cuando esta proteína está alterada por anomalías en su gen, se altera la secreción de agua y bicarbonato, provoando acidificación e insuficiente hidratación en las secreciones, produciéndolas viscosas y con la consiguiente formación de tapones proteicos, dando lugar a fibrosis pancreáticas y Sd. MAI. Es el trastorno genético autosómico recesivo más común entre los niños caucásicos. La incidencia es variable: menos frecuente en asiáticos y africanos Prevalencia: entre 1/3.000 y 1/10.000 individuos, dependiendo de la comunidad. La fibrosis quística se trata de una enfermedad crónica y generalmente progresiva que suele aparecer en infanciatemprana o raramente en nacimiento (íleo meconial), dando como manifestaciones clínicas: afectación pulmonar (bronqiolitis, sobreinfecciones bacterianas, atelectasias¿), afectación digestiva (íleo meconial, obstrucción ileal, MAI, déficis de vitaminas liposolubles¿), cirrosis biliar, Diabetes Mellitus, azoospermia obstructiva, alcalosis hipoclorémica, aumento del gasto energético¿ DIAGNÓSTICO DE LA FIBROSIS QUÍSTICA : 1.- Diagnóstico bioquímico: ¿ Tripsina inmunorreactiva ¿ Test del sudor: Se estimula la producción de sudor por iontoforesis con pilocarpina y se recoge en un colector ¿ Cl> 60 mmol/l confirma el diagnóstico de FQ. ¿ Cl < 30 mmol/l. : diagnóstico se puede excluir. ¿ Cl 30-59 mmol/l : dudosas, recomendándose la realización de un estudio genético. 2.- Diagnóstico genético: ¿ Primera mutación encontrada: deleción de los 3 pares de bases (TTT, en el exón 1.501-1.681) hace que la CFTR carezca de fenilalanina en posición 508 ¿ Es la mutación más frecuente: en caucásicos aproximadamente el 50% de los pacientes afectos de FQ son homocigotos para esta mutación. ¿ Se han identificado más de 1800 mutaciones, cerca del 70% son causadas por esta mutación, mientras que otras 30 mutaciones explicarían el otro 20 % más. ¿ Polimorfismos genéticos pueden tener un impacto en los niveles de CFTR funcional y en el fenotipo FQ. El número de timinas (5, 7 ó 9) presentes en el intrón 8 determina la eficiencia del intrón, disminuyendo cuanto más pequeño el número de timinas. ¿ La presencia de una mutación CFTR en un alelo y la variante 5T en el otro puede conducir a un déficit de transcripto normal ¿ El número de repeticiones TG adyacentes a 5T influye en la penetrancia de la enfermedad 3.-Cribado neonatal: ¿ En 1979 se demostró que recién naciso con fibrosis quística tenían concentraciones más elevadas de tripsina en sangre. ¿ Basado en la determinación en recién nacido, de tripsina inmunorreactiva (TIR) en sangre seca de talón recogida mediante papel filtro ¿ Aumentado en los pacientes con FQ, probablemente en relación a la obstrucción de los conductos pancreáticos Se ha demostrado la importancia de un diagnóstico temprano para un tratamiento precoz y una correspondiente disminución de la morbimortalidad. Ventajas cribado neonatal fibrosis quística: ¿ Descenso de la colonización crónica por microorganismos ¿ Mejoría de la función pulmonar ¿ Mejoría del estado nutricional ¿ Mejoría del desarrollo cognitivo del niño ¿ Disminución del número de hospitalizaciones ¿ Disminución de la mortalidad ¿ Pretratamiento sintomático ¿ Mayor confianza en la profesión médica ¿ Posibilidad planificación familiar precoz una vez diagnosticada la enfermedad en el primer hijo ¿ Permitir el estudio de portadores en familiares de riesgo 4.- Estrategia cribado neonatal fibrosis quística 2.-JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO El Programa de la Comunidad Valenciana ha instaurado recientemente el Cribado Neonatal de fibrosis quística, para ello es importante: ¿ Establecer valores de referencia para cada programa, dado el distinto grado de prevalencia en cada comunidad ¿ Posible necesidad de valores de referencia en diferentes periodos del año, dado que la bibliografía presenta diferentes valores de tripsina inmunorreactiva (TIR) dependiendo con la temperatura ambiental. ¿ Porcentaje alto de nacimientos de madres de otros países, puesto que desde la década de los 90, España ha sido el escenario de un importante fenómeno inmigratorio. 3.- OBJETIVOS ¿ Determinar percentiles de TIR durante el primer año del programa. ¿ Evaluar posible variación de TIR durante los meses del año. ¿ Valorar posibles variaciones de TIR con el sexo. ¿ Determinar la influencia de la edad gestacional en los valores de TIR. ¿ Valorar la influencia del tipo de alimentación sobre la TIR. ¿ Valorar la influencia de la edad materna sobre los niveles de TIR. ¿ Determinar si los valores de referencia han de modificarse según origen de la madre. ¿ Evaluar con los datos de los estudios genéticos realizados y las mutaciones encontradas, la posibilidad de modificar los valores de referencia a los nuevos percentiles encontrados. 4.- MATERIAL Y MÉTODOS ¿ Población: muestras de sangre desecada sobre papel de todos los recién nacidos en Alicante desde marzo de 2012 a febrero de 2013, ambos inclusive ¿ Variables: ¿ edad gestacional ¿ sexo ¿ tiempo desde el nacimiento a la extracción de sangre ¿ tipo de lactancia ¿ edad materna ¿ país de origen de la madre ¿ Criterios de inclusión: niños en los que la muestra de sangre desecada sobre papel estaba acorde con los criterios de calidad ¿ Obtención muestras: mediante punción en el talón impregnádose en papel CF12 siguiendo procedimiento de la SEQC ¿ Tamaño muestral: 14782 neonatos ¿ Antes de la extracción se rellena formulario utilizado por programa de Cribado Neonatal de la Comunidad Valenciana con consentimiento informado ¿ Método de cuantificación de TIR en sangre desecada en papel: consiste en la reacción inmunológica entre una molécula de antiTIR-IgG en un pocillo de titulación que reacciona con sangre, previamente eluìda del papel de filtro. Posteriormente se incuba con una nueva molécula de antiTIR-IgG marcada con Europio, soluble en medio de incubación. Posteriormente se mide la luorescencia, siendo ésta directamente proporcional a la concentración de TIR. ¿ CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO: ¿ Sensibilidad analítica: 2,9 ng/ml ¿ Linealidad desde 16 ng/ml hasta 480 ng/ml ¿ Imprecisión: Concentración (ng/ml) CV intraensayo (%) CV interensayo (%) 22.5 7.4 9.6 104 7.1 8.0 ¿ CONTROLES DE CALIDAD ¿ Control de calidad interno: en cada serie analítica se introducen tres controles proporcionados por Perkin Elmer junto con el Kit Neonatal AutoDelfia TIR de concentraciones aproximadas de 30, 60 y 90 ng/ml. ¿ Control de calidad externo: se participa en los siguientes programas de intercomparación, según las recomendaciones establecidas: - Infant Screening Quality Assurance Program. Center for Disease Control (CDC) Atlanta. USA - Programa de Evaluación Externa de la Calidad de la Asociación Español de Cribado Neonatal (AECNE). ¿ ESTUDIO GENÉTICO: A todas las muestras con TIR ¿ 65 ng/ml se les realizó estudio genético en el laboratorio de Genética del Hospital la Fé de Valencia, analizando las 51 mutaciones en el gen CFTR más frecuentes en España mediante el sistema de análisis ELUCIGENE CF-EU2v1 (Gen- Probe Life Sciences LtdP). El nivel de detección de este ensayo es ¿ 80% de mutaciones. Se ha incluido el estudio del polimorfismo IVS8-9T, IVS8-7T, IVS8-5T (junto con el número de repeticiones de TG adyacentes). ¿ TRATAMIENTO ESTADÍSTICO: Se realizó con el paquete estadístico IBM SPSS Stadistics 20.0 y el Epidat 4.0. ¿ Se utilizaron pruebas no paramétricas: - U de Mann-Whitney - Kruskal Wallis ¿ Para frecuencias de variables cualitativas: - Chi cuadrado Se empleo el modelo multivariante de regresión logística para estimar las odds ratio 5.- RESULTADOS Los valores de TIR no presentan una distribución normal según la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. A) Análisis de cada variable de forma independiente - Existe gran similitud de la población estudiada con poblaciones semejantes descritas en la bibliografía. - 1.-INFLUENCIA DEL SEXO EN LOS VALORES DE TIR N Media SD P (Kruskal-Wallis) Niños 7592 21,5 13,7 0,000 Niñas 7238 22.8 13.5 Percentil 50 95 99 99,5 Niños 18,5 44,0 67,4 77,5 Niñas 19,6 47,1 70,6 83,5 Niveles más altos de TIR en las niñas respecto a los niños. - 2.- INFLUENCIA DE LA EDAD NEONATAL EN LOS VALORES DE TIR Los niveles TIR prácticamente constantes hasta el día 20 de vida para después descender de forma significativa como apuntan otros estudios. - 3.- VARIACIÓN DE TIR CON EDAD GESTACIONAL: GRUPO EG n MEDIA SD MEDIANA P90 P95 P99 ¿ 32 sem 158 27,3 20,6 21,3 51,3 64,5 83,0 32-37 sem 978 23.2 11,7 20,5 38,0 45,9 64,2 ¿ 37 sem 13310 22,0 13,7 18,8 36,8 45,4 69,3 Se obseva TIR más elevada cuanto menor es la edad gestacional(EG) del niño. - 4.- VARIACIÓN TIR CON TIPO DE ALIMENTACIÓN: TIR no varía de forma significativa entre los tres grupos de alimentación,existiendo elevación de los niveles de TIR en neonatos con dieta absoluta. - 5.- INFLUENCIA DE LA EDAD MATERNA EN LOS VALORES DE TIR Se obsevan valores de TIR mayores en los extremos de edad de la madre. - 6.-INFLUENCIA DEL ORIGEN ÉTNICO MATERNO EN LOS VALORES DE TIR Valores TIR superiores en los RN de origen africano y ligeramente inferiores en los neonatos de madres asiáticas y americanas. - 7.-INFLUENCIA DE LA ESTACIONALIDAD EN LOS VALORES DE TIR No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de TIR con los meses de nacimiento. Por tanto: ¿ Los valores de TIR son superiores en meses de invierno, en niños con dieta absoluta, RNMP, a edades extremas de la madre y en neonatos cuya madre es de origen africano. ¿ Los niveles de TIR son menores en meses de verano, a partir de los 20 días de edad de neonato, niños a término. B) Análisis multivariante Debido a que unas variables están relacionadas con otras, se realiza un estudio multivariante para eliminar factores de confusión, cuyos resultados fueron: Sig. (p) OR I.C. 95% para OR Sexo ns 1,1 0,9-1,5 África vs resto 0,055 1,6 1,0-2,5 Días extracción < 20 vs ¿ 20 ns 1,5 0,2-10,6 Edad materna Grupo EM < 20 vs 20-40 años ns 1,6 0,8-3,4 Grupo EM > 40 vs 20-40 años ns 1,0 0,5-2,4 Edad gestacional EG(1) ns 1,4 0,5-4,2 Grupos EG(2) 0,067 0,6 0,3-1,0 LACTANCIA LM vs L F 0,022 0,5 0,3-0,9 LM vs L mixta ns 0,7 0,5-1,1 LM vs Dieta 0,000 22,4 7,1-70,5 Temperatura media 0,067 1,0 1,0-1,0 Destacando elevados niveles de TIR en neonatos de madres de etnia africana y los que están con dieta absoluta. VALORES DE REFERENCIA DE TIR EN EL CRIBADO NEONATAL DE FIBROSIS QUÍSTICA A partir de los datos reflejados anteriormente, parece aconsejable, buscando un menos número de repeticiones o realizaciones d estudios genéticos, optimizar el punto de corte a partir de percentiles adcuados. Para ello, la siguiente tabla muestra los siguientes percentiles excluyendo a los niños con dieta asoluta o de made africana: grupo Percentiles de TIR (ng/ml) 5 10 25 50 75 90 95 99 99,5 Total (14872) 8,8 10,5 13,7 19,0 26,6 37,1 45,8 69,4 80,7 Estándar (13244) 8,8 10,4 13,7 18,9 26,4 36,8 45,3 68,8 79,0 Si nos centramos sólo en neonatos de madres africanas: Percentiles de TIR (ng/ml) 5 10 25 50 75 90 95 99 99,5 8,6 10,6 13,8 19,8 28,9 41,4 54,1 97,7 137,0 Para los valores de normalidad excluyendo los RN con dieta absoluta y nacidos de madres africanas, el punto de corte se puede establecer en 68,8 ng/ml. Para los niños de madres norteafricanas subir el punto de corte a 97,7 ng/ml. Respecto a los niños que reciben dieta absoluta, demorar la toma de muestra para la determinación de TIR. VALORES ALTOS DE TIR Y ESTUDIOS GENÉTICOS Se han encontrado entre los 14872 neonatos, 199 muestras con valores superiores al punto de corte (>65 ng/ml) de TIR. Supone un porcentaje de muestras a seguir en estudio genético del 1,34%. Mutaciones encontradas en recién nacidos con TIR ¿ 65 ng/ml. : MUTACIÓN n % ALELO 1 Sin mutación 183 92,0 ¿F508 9 4,5 D1152H 4 2,0 R1162X 2 1,0 L206W 1 0,5 ALELO 2 Sin mutación 198 99,5 ¿F508 1 0,5 Con estos valores, se ha encontrado una incidencia durante el año analizado para FQ de 1/14872. Número de portadores encontrados de la mutación ¿F508 de 1/22, prácticamente la descrita para la población general, y por tanto el cribado de fibrosis quística mediante TIR no discrimina de una forma específica a los portadores de dicha mutación Combinaciones de mutaciones y polimorfismos en las muestras con TIR¿ 65 ng/ml (n=199). Mutación Polimorfismo 1 F508 del/F508 del 1 9T/9T 8 F508 del -3 8 7T/9T -3 4 D1152H -1 3 7T/7T 1 7T/9T -1 2 R1162X 2 7T/7T 1 L206W 1 7T/7T 183 Sin mutación encontrada -46 10 (5,5%) 5T/7T 3 (1,6%) 5T/9T 126 (68,9%) 7T/7T -25 43 (23,5%) 7T/9T -12 3 (1,6%) 9T/9T En rojo pérdidas que se producirían al aumentar punto de corte a 68,8 ng/ml de TIR 6.- CONCLUSIONES 1.- Los percentiles de normalidad establecen un punto de corte de 68,8 ng/ml de TIR, mayor que el utilizado (65 ng/ml) en el primer año de implantación del Cribado Neonatal de FQ. 2.- Evaluando la muestra total de RN analizados con el punto de corte de 68,8 ng/ml en lugar de 65 ng/ml se pueden evitar 50 estudios genéticos. 3.- La Tª ambiente es un factor a tener en cuenta a la hora de determinar los valores de referencia de TIR, pues aunque en la provincia de Alicante no existen diferencias importantes de ºC entre las diferentes estaciones, existen otras comunidades donde esta variable podría influir. 4.- El sexo del recién nacido no influye sobre los niveles de TIR. 5.- Los recién nacidos muy pretérminos (<32 semanas) dan valores de TIR superiores a los nacidos a término. 6.- Los recién nacidos con dieta absoluta dan valores de TIR muy superiores, con una probabilidad 20 veces mayor de estar por encima del valor de referencia establecido y sin mutaciones. 7.- Es aconsejable realizar el cribado de FQ a los neonatos con dieta absoluta, una vez inicien alimentación materna, fórmula o mixta, entre las que no se han determinado diferencias en las concentraciones de TIR. 8.- Valores extremos de edad materna (>40 años y <20 años) parecen tener impacto sobre el aumento de niveles de TIR, por mayor número de RNPT y patología peri-neonatal, pero al realizar el estudio multivariante se demuestra que no influye en dichos niveles. 9.- La etnia africana, concretamente los niños nacidos de madres norteafricanas tienen niveles de TIR mayores que los de otras etnias. 10.- Si se establece como criterio el punto de corte para los recién nacidos de madre africana de 97,7 ng/ml de TIR, el número de niños descartados del estudio genético hubiese sido de otros 9 niños, sin pérdida de ninguna de las mutaciones encontradas. 11.- Ninguno de los estudios genéticos que se hubieran rechazado utilizando el nuevo punto de corte habrían dado positivo con 2 mutaciones o polimorfismos de riesgo.