Insights into nitrogenase biosynthesis obtained from thermophilic prokaryotes

Resumen

La fijación biológica de nitrógeno (FBN) es un proceso enzimático con un alto coste energético encargado de la rotura del triple enlace del nitrógeno molecular (N2; N≡N) para producir dos moléculas de amonio (NH3). La FBN es llevada a cabo exclusivamente por unos pocos microorganismos pertenecientes a los dominios Bacteria y Arquea, conocidos como diazotrofos. Todos los microorganismos diazotrofos fijan N2 empleando el complejo multienzimático nitrogenasa. En función de la composición de sus cofactores metálicos, esenciales para su actividad, las nitrogenasas se clasifican en: nitrogenasas de molibdeno (Mo), vanadio (V) o de hierro (Fe). Todos los diazotrofos contienen al menos la nitrogenasa de molibdeno, mientras que otros pueden contener adicionalmente las nitrogenasas de vanadio y/o hierro. Por lo tanto, la nitrogenasa de molibdeno es las más abundante y es propuesta como el predecesor evolutivo de las nitrogenasas alternativas de vanadio y hierro. Las nitrogenasas de molibdeno, así como el conjunto de proteínas requeridas para su ensamblaje, función y regulación, están codificadas por una serie de genes conocidos como nif (“nitrogen fixation genes”). La cantidad y composición de genes nif varía en función de las necesidades fisiológicas y ecológicas de cada diazotrofo. Sin embargo, se ha establecido un mínimo de seis genes nif como criterio esencial para la fijación de nitrógeno dependiente de molibdeno (nifHDKENB). En la presente tesis se investiga la nitrogenasa de la bacteria termófila Roseiflexus sp. RS-1, que parece depender exclusivamente de los cuatro genes nifHBDK. Los componentes estructurales de la nitrogenasa NifH y NifDK, así como el componente biosintético NifB, han sido caracterizados. La demostración de la actividad in vitro de los tres componentes Nif de Roseiflexus sp. RS-1 demuestra la existencia de una ruta alternativa en la biosíntesis del cofactor de hierro y molibdeno (FeMo-co). En Roseiflexus sp. la síntesis del cofactor FeMo-co parece ser independiente de NifEN, mientras que NifDK parece tener una capacidad dual, participando en la maduración de FeMo-co así como, manteniendo su actividad nitrogenasa. Estos resultados sugieren que Roseiflexus sp. posee un complejo enzimático que se asemeja al predecesor de las nitrogenasas de molibdeno actuales antes de los eventos de duplicación y divergencia de los genes nifDK y nifEN. Además, esta tesis incluye la primera descripción de la estructura de NifB obtenida por rayos X. Debido a que la proteína NifB de Roseiflexus sp. RS-1 no pudo ser cristalizada, la estructura de su homólogo procedente de Methanotrix thermoacetophila fue finalmente resuelta en colaboración con el grupo del Dr Yvain Nicolet del “Institute de Biologie Structurale”. Se ha descrito una coordinación novedosa de uno de los cofactores [Fe4S4], constituida por dos cisteínas, una histidina y un ácido glutámico. La mutagénesis dirigida sobre residuos de NifB, así como los ensayos bioquímicos llevados a cabo en esta tesis permitieron refinar un modelo catalítico para la síntesis del precursor NifB-co, donde una región flexible delimitada por los residuos C62 y E65 tiene un papel central en la coordinación de la unión y catálisis de la molécula de SAM, y en la estabilización de los cofactores [Fe4S4].