Generación y caracterización de una línea de pez cebra mutante para el gen de glaucoma congénito CYP1B1 mediante edición genómica CRISPR/Cas9

Abstract

El glaucoma congénito primario (GCP) es una patología ocular neurodegenerativa infrecuente (<1/10.000 nacidos vivos) caracterizada por un desarrollo embrionario anormal del ángulo iridocorneal que conduce a un incremento de la presión intraocular y la ceguera progresiva por apoptosis de células ganglionares de la retina. La pérdida de función del gen CYP1B1 es la principal alteración genética conocida relacionada con su desarrollo, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes son todavía poco conocidos. El principal propósito de este trabajo fue establecer y caracterizar una línea de pez cebra knockout (KO) para el gen cyp1b1 para evaluar su utilidad como un nuevo modelo animal de GCP, utilizando la herramienta de edición genómica CRISPR/Cas9. Esta línea, denominada cyp1b1∆133, es portadora de la mutación c.535_667del, que da lugar a una reducción del 72% del ARN mensajero (ARNm) y que induce un desplazamiento de la pauta de lectura del gen que produciría una proteína truncada inactiva (p.(His179Glyfs*6)). En un 23% de las larvas mutantes somáticas F0 (144 hpf) se observó la aparición de microftalmia, defectos craneofaciales y un mal desarrollo de la mandíbula. Estos fenotipos tempranos no se detectaron en las larvas de la línea mutante de cyp1b1 estable (F3, 144 hpf), pero se observó una disminución del tamaño del corion en los huevos de las hembras adultas mutantes para cyp1b1 en comparación con los de las hembras adultas silvestres, así como un retraso en el desarrollo de las larvas cyp1b1 KO durante las primeras 24 hpf. Además, el 27% de los peces cebra cyp1b1 KO adultos (4 meses) mostraron alteraciones craneofaciales uni o bilaterales, lo que indica la existencia de penetrancia incompleta y expresividad variable. Estos fenotipos aumentaron hasta el 86% en la descendencia adulta resultante de los cruces de progenitores con defectos craneofaciales, lo que indica que estos fenómenos se relacionan con efectos de compensación genética. No se observaron fenotipos específicamente relacionados con glaucoma en los peces mutantes para cyp1b1. Los análisis transcriptómicos de la descendencia (7dpf) de progenitores mutantes para cyp1b1 con defectos craneofaciales revelaron un enriquecimiento funcional de genes diferencialmente expresados relacionados con matriz extracelular y adhesión celular, crecimiento y proliferación celular, metabolismo de los lípidos (retinoides, esteroides y ácidos grasos), procesos de oxidación-reducción que incluían varios genes de la familia de los citocromos P450 y de genes relacionados con inflamación. El análisis transcriptómico de larvas KO cyp1b1 descendientes de progenitores sin fenotipos craneofaciales mostraron la alteración de vías en común, como adhesión celular, biosíntesis de hormonas esteroideas o metabolismo de xenobióticos por citocromos P450. No obstante, presentaban otras vías alteradas específicas que podrían participar en los mecanismos de compensación dependientes del fondo genético. Un análisis metabolómico preliminar de larvas deficientes en cyp1b1 procedentes de mutantes con fenotipo apoyó el resultado del análisis transcriptómico, mostrando la alteración del metabolismo de lípidos y aminoácidos, de algunas carnitinas, espermina, espermidina y de taurina. Este estudio muestra la complejidad de los fenotipos y las vías moleculares asociadas a la pérdida de función de cyp1b1, dependiendo de la especie de estudio, y aporta pruebas de la desregulación de la expresión de genes de matriz extracelular como uno de los mecanismos subyacentes a la patogenicidad asociada a la pérdida de función de cyp1b1. Además, contribuye a la creciente evidencia del fenómeno de la compensación genética y revela nuevos conocimientos sobre la posible función de cyp1b1 en el desarrollo de GCP. Se espera que estos análisis contribuyan a la comprensión del papel de CYP1B1 en el desarrollo de glaucoma congénito en pacientes.