Estudio de los cambios funcionales, anatómicos y moleculares en el sistema nervioso central en respuesta a distintos tipos de trasplante de células madre

Resumen

INTRODUCCIÓN La retina, parte del SNC, ofrece una ventana de fácil acceso al estudio de la degeneración neuronal. El aplastamiento del nervio óptico (ApNO), es un modelo de degeneración de CGR bien estudiado en roedores. Las terapias de neuroprotección intentan prevenir o retrasar los procesos neurodegenerativos. Sin embargo, las terapias celulares no están teniendo las altas tasas de éxito como se esperaba. OBJETIVOS Los objetivos generales de esta tesis son: 1. Evaluar el uso de los tejidos perinatales en oftalmología mediante búsqueda bibliográfica de modelos preclínicos. 2. Estudiar el efecto de las células MO-CEM en cuatro tipos trasplantes sobre la funcionalidad y arquitectura de la retina sana. 3. Evaluar la importancia del tipo de trasplante en el efecto neuroprotector y neurorregenerativo de las MO-CEM. 4. Estudiar la capacidad neuroprotectora de las vesículas derivadas de MO-CEM tras el ApNO en trasplante singénico. 5. Analizar el efecto neurotóxico y neuroprotector del clon TEG3 en la retina sana y tras el aplastamiento del nervio óptico. 6. Evaluar diferencias en la expresión génica de células de microglía. MATERIAL Y MÉTODOS En los experimentos de esta tesis se utilizaron ratones de las cepas: C57/BL6 pigmentados, BALB/c albinos, y transgénicos C57BL/6-Tg(CAG-EGFP). También se utilizaron ratas de la cepa Sprague Dawley (SD). Las células elegidas para los experimentos fueron las células estromales mesenquimales procedentes de médula ósea (MO-CEM) murinas y humanas, y la línea inmortalizada de glía envolvente olfatoria TEG3. La degeneración de CGR se indujo mediante ApNO a 0,5 mm del globo ocular. La inyección de células y vehículo se realizó mediante inyección intravítrea. El suministro de minociclina se realizó mediante inyección intraperitoneal al igual que la dexametasona que se combinó con ciclosporina A oral en el agua. Se realizaron experimentos in vivo para mediante SD-OCT y de la función mediante ERG. Se realizaron estudios moleculares de expresión génica mediante PCRc y cuantificación de citoquinas mediante ensayos de inmunoabsorción (ELISA) y scRNA secuenciación. También se realizaron experimentos de inmunofluorescencia en retinas tanto a corte como a plano. La cuantificación de CGR se realizó de manera automática y se estudió su distribución mediante mapas de isodensidad y/o mapas de vecinos. Se realizó una búsqueda bibliográfica sistemática sobre el uso de tejidos perinatales (PnD) en modelos preclínicos en oftalmología. Los análisis estadísticos se realizaron en el programa GraphPad® Prism v6. Las diferencias se consideraron significativas cuando p valor < 0,05. RESULTADOS En la revisión bibliográfica sobre el uso de PnD observamos que la mayoría de estudios usaban la hMA como tejido completo para tratar defectos corneales. En el estudio del trasplante singénico, alogénico y xenotrasplante de MO-CEM en la retina no lesionada vimos que el xenotrasplante es el más agresivo disminuyendo la funcionalidad del tejido y alterando la estructura. En cuanto a la neuroprotección de las MO-CEM, el trasplante singénico era el único capaz de proteger significativamente de la muerte a las dos subpoblaciones de CGR, y el número de axones regenerados fue mayor. La inyección intravítrea de vesículas extracelulares derivadas de MO-CEM murinas demostró mejores efectos neuroprotectores que las propias células a los 5 días tras ApNO. En el estudio de la inyección intravítrea del clon TEG3 observamos que activa a las células de microglía y causa una pérdida de CGR a los 21 días, aunque neuroprotege de la muerte tras ApNO a los 7 días. En el estudio de la expresión génica de las células de microglía xenotrasplantadas vimos que en esta respuesta inmunitaria participan 12 grupos de células activas (microglía/macrófagos). CONCLUSIONES Existe una falta de homogeneidad en los estudios preclínicos de PnD en oftalmología. El tipo de trasplante de MO-CEM afecta la estructura y funcionalidad de la retina sana. Las vesículas extracelulares derivadas de MO-CEM mejoran las propiedades neuroprotectoras de las MO-CEM. El trasplante de células TEG3 produce una reducción de la población de CGR y una neuroprotección tras ApNO en alogenia. El xenotrasplante de MO-CEM en retinas intactas activa la vía de respuesta inmune adaptativa.