Interaction of calmodulin with members of the ErbB receptor family and the Grb7 adaptor protein

Resumen

El receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una tirosina quinasa que pertenece, junto con otros tres miembros relacionados, a la familia de receptores ErbB. Estos receptores fosforilados y activados generan una serie de eventos de señalización dirigidos a iniciar proliferación celular, diferenciación, migración celular y/o reaciones antiapoptoticas. En esta Tesis, mostramos que la calmodulina (CaM) en presencia de Ca2+ forma parte de un complejo de alto peso molecular formado después del entrecruzamiento covalente del EGFR humano inmunoprecipitado de células de carcinoma epidermoide humano A431 y fibroblastos murinos EGFR-T17 que sobreexpresan el receptor humano. Hemos demostrado usando técnicas de hibridación que la CaM biotinilada se une directamente al receptor de una manera dependiente de Ca2+ sin la mediación de proteínas adaptadoras dependiente de CaM. La CaM se une al EGFR con una constante de disociación aparente (K'd) de aproximadamente 0.17-0.5 uM. También se presentan evidencias de la co-inmunoprecipitación de la CaM con el EGFR. Además, hemos demostrado en células SK-BR-3 de adenocarcinoma de mama humano que el receptor ErbB2, otro miembro de esta familia, también une directamente CaM en presencia, pero no en ausencia de Ca2+. Grb7 es un miembro de una familia de proteínas adaptadoras que incluyen Grb7, Grb10 y Grb14, que se unen a través de su dominio SH2 a receptores tirosina quinasa. Recientemente, varias evidencias indican que Grb7 y su variante Grb7V, que carece del dominio SH2, están involucradas en migración celular. Utilizando cromatografía de afinidad a la CaM hemos demostrado que Grb7 de células SK-BR-3 se une a CaM-agarosa. Overlay de Grb7 y Grb7V recombinantes con CaM biotinilada indica que su interacción es directa y dependiente de Ca2+. Determinamos que la K'd de CaM por Grb7 es aproximadamente de 30 nM. Se identificó una secuencia aminoacídica anfifílica básica que