Genetic and molecular analysis of small regulatory RNAs in Salmonella enterica

Zusammenfassung

En bacterias, los ARN no codificantes reguladores o "ARNs pequeños" (sRNA) regulan la expresión de genes-diana interaccionando con la región 5’ no traducida del ARN mensajero y facilitando o dificultando el acceso del ribosoma y/o la degrad ... ación del dúplex de ARN. La regulación mediada por sRNA participa en procesos de adaptación a cambios ambientales o condiciones de estrés. En bacterias gram-negativas, condiciones que afectan al plegamiento de proteínas de la membrana externa (OMPs) activan el factor sigma alternativo ?E, responsable de la transcripción de un conjunto de genes cuyos productos confieren tolerancia a dichas condiciones. En los estudios realizados durante esta tesis, se describió la activación constitutiva de la respuesta mediada por ?E en ausencia de Hfq. La proteína Hfq es una “chaperona de ARNs” esencial para la estabilidad y función de la inmensa mayoría de sRNAs. Los experimentos realizados durante esta tesis definieron que la inducción de la respuesta ?E se debe a la estimulación de la degradación de un factor anti-?E llamado RseA, que en condiciones normales secuestra a ?E, impidiendo su acción. Se describió que la degradación de RseA está relacionada con la pérdida de la represión de varias OMPs por parte de dos sRNAs pertenecientes al regulón ?E: MicA y RybB.MicA reprime la traducción de las proteínas de la membrana externa OmpA y LamB. Por su parte, RybB inhibe la síntesis de varias proteínas de la membrana externa, reprimiendo la traducción y/o estimulando la degradación de los correspondientes ARNs mensajeros. Dos de los ARNm-diana son el de ompC y el de ompD. Con el objeto de identificar las secuencias determinantes en la interacción RybB:ompC, obtuvimos mutantes alterados en dicha interacción gracias a un procedimiento que combina la PCR mutagénica con la recombinación mediada por el sistema lambda Red. Fragmentos de ADN que contenían el gen rybB o la región situada corriente abajo del promotor de ompC fueron amplificados en condiciones propensas a error y transferidos al cromosoma de una estirpe que porta una fusión ompC::lacZ y expresa constitutivamente ?E. Los mutantes se detectaron por cambios de color en placas indicadoras. De este modo se obtuvo una colección de mutantes, posteriormente ratificados por secuenciación y caracterizados por Northern. Esta estrategia ha permitido identificar las secuencias de ARN implicadas en la interacción RybB:ompC, así como las relacionadas con la estabilidad de RybB y la interacción con la proteína Hfq. Analizando los efectos de los mutantes en RybB sobre ompD, se ha descrito el primer ejemplo de interacción pequeño ARN:ARNm en dos localizaciones diferentes, con la particularidad adicional de que dichas interacciones tienen lugar dentro de la secuencia codificante del gen. Además, se ha descrito un nuevo gen perteneciente al regulón RybB: la quitoporina ChiP. Durante esta tesis también se estudió la posible participación de los sRNA en procesos biológicos más allá de la regulación de la expresión génica. Se definió la existencia de un locus, en el que están codificados dos sRNAs (ryeA y ryeB), que ha resultado un punto preferente de inserción de profagos bacterianos. Además, se describió que dicha inserción tenía efecto sobre los niveles de expresión relativa de ambos sRNAs, invirtiéndola, y sugiriendo unas consecuencias biológicas aún por estudiar. En cualquier caso, la clara implicación de los profagos, en tanto que elementos genómicos móviles, en procesos de transferencia genética horizontal, convierte a los sRNAs en principales participantes del proceso de evolución bacteriana. El conjunto de estudios realizados ha subrayado la enorme utilidad de la genética clásica en el estudio de la regulación mediada por pequeños ARN no codificantes, y ha supuesto el esclarecimiento de eventos clave en dichos procesos.