Curso temporal de la degeneración axonal, muerte de células ganglionares de la retina y activación de la caspasa 3 en retinas de roedor adulto tras lesión axonal

Resumo

RESUMEN Objetivos - Investigar si la expresión de Brn3a tras axotomía del nervio óptico desaparece porque las CGR mueren, o porque se ha producido una alteración celular como consecuencia de la lesión axonal, independientemente de que las CGR sigan vivas. - Analizar y comparar el curso temporal de pérdida de las CGR y la activación de caspasa 3 después de corte (SNO) o aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en ratón. Evaluar la supervivencia de las CGR y la activación de la caspasa 3 tras la administración del factor trófico derivado de cerebro (BDNF) o del inhibidor de la caspasa 3 (ZDEVD_fmk). - Analizar, en ratón, la supervivencia de las CGR que expresan Brn3a o melanopsina a largo plazo después de SNO o ApNO y estudiar la degeneración de los axones intrarretinianos de las CGR. Material y Métodos Animales: Para la realización de estos objetivos se han utilizado ratas hembra adultas y albinas (Sprague-Dawley de 180-200 gr de peso) y ratones machos, adultos y albinos (Swiss de 30-32 gr de peso). Los animales han sido tratados según la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD53/2013) vigente sobre la protección de los animales que son utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Todas las manipulaciones y procedimientos experimentales que implicaban dolor, sufrimiento o lesión fueron realizadas bajo anestesia. Los animales se anestesiaron intraperitonealmente (i.p.) con una mezcla de Ketamina (70 mg/kg de peso corporal) y Xilacina (10 mg/kg de peso corporal). La eutanasia se realizo con una sobredosis letal de una solución de pentobarbital sódico al 20% inyectado i.p. (0.5-1 ml). Lesión del nervio óptico: Se realizó la sección (SNO, en rata y ratón) o el aplastamiento (ApNO, en ratón) del nervio óptico izquierdo. Ambas cirugías se realizaron a 0.5 mm de la cabeza del nervio óptico. Las retinas se analizaron a tiempos crecientes tras estas cirugías (de 1 a 90 días, n=4-8 por cirugía, tiempo y especie). Como control se usaron retinas de animales intactos o las retinas derechas, contralaterales a la lesión. Inyección intravítrea: Los productos administrados fueron: BDNF (5 ?g en rata, 2,5 ?g en ratón), el inhibidor irreversible de caspasa 3 ZDEVD_fmk (125 ng/inyección, en ratón), y los correspondientes vehículos. En general, se realizó un solo tratamiento justo después de la lesión de nervio óptico. En el caso del ZDEVD_fmk se hicieron grupos adicionales de animales en los que se administro a los 2 días de la lesión o se hicieron múltiples inyecciones. Para descartar posible toxicidad del inhibidor, éste se examinó en un grupo sin lesión de nervio óptico. Las retinas fueron analizadas a distintos tiempos tras el tratamiento (de 3 a 14 días, n=4-6/ grupo). Procesado y disección de las retinas: Para la realización de Western Blotting, las retinas se disecaron en fresco, y se congelaron inmediatamente. Para los estudios anatómicos, los animales se perfundieron con paraformaldehído y las retinas fijadas se disecaron a plano. Inmunodetección: Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: i/ cabra anti-Brn3a para detectar la población general de CGR, ii/ conejo anti-melanopsina, para identificar la subpoblación de CGR m+; iii/ conejo anti-caspasa 3 activa, para detectar células en apoptosis y, iv/ ratón anti-pNFH (clon RT97) para detectar los axones intrarretinianos de las CGR. La detección secundaria se efectuó con anticuerpos acoplados a los fluoróforos Alexa 488 o 594. Adquisición de imágenes: Todas las retinas montadas a plano se examinaron y fotografiaron en el microscopio de fluorescencia asociado a una cámara CCD y equipado con una platina motorizada controlada por un sistema de análisis de imagen: Image-Pro Plus¿ (IPP 5.1; Media Cybernetics). Para hacer reconstrucciones de las retinas completas se capturaron imágenes individuales de forma secuencial y no solapada comprendiendo toda la superficie de la retina y posteriormente fueron unidas para formar el fotomontaje (154/140 imágenes individuales por retina). Cuantificación: El número total de CGR trazadas en retinas control y de CGR Brn3a+ en retinas control o lesionadas se cuantificó automáticamente con el programa Image-Pro Plus. En retinas lesionadas el número de CGR trazadas se estimó a partir de contajes manuales de 12 muestras de la retina porque la presencia de células de microglía transcelularmente marcadas con el trazador impide el contaje automático.Las CGR m+, CGR a-caspasa 3+ y los somas de CGR pNFH+ se puntearon sobre el fotomontaje y su número se cuantificó automáticamente usando el programa Image-Pro Plus. Topografía: Para conocer la distribución topográfica de las CGR FG+ y CGR Brn3a+ se realizaron mapas de isodensidad. La distribución de las CGR m+, CGR-a-caspasa 3+ y somas de CGR pNFH+ se visualizó usando el método del vecino más próximo (mapas de vecinos). Estos mapas se realizaron con el programa Sigma Plot (SigmaPlot¿11, Systat Software). Estadística: El análisis estadístico y de regresión se llevo a cabo con los programas SigmaStat (Systat Software) o GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0,05. Resultados Investigar si la expresión de Brn3a tras axotomía desaparece porque las CGR mueren, o porque se ha producido una alteración celular como consecuencia de la lesión axonal, independientemente de que las CGR sigan vivas. Para realizar este objetivo se usó como modelo la rata albina. Se realizaron dos grupos experimentales. Una semana antes de la lesión de nervio óptico se trazaron las CGR desde los CS con el trazador FG. Pasada esta semana, se seccionó el nervio óptico (SNO) izquierdo de todos los animales. En un grupo justo después de la SNO se administró 5 µg de BDNF intravitrealmente en la retina izquierda, y en el otro se administró el mismo volumen de vehículo. Las retinas fueron analizadas a 7, 9 y 12 días después de la lesión (n=6-8/ tiempo y tratamiento). Las retinas derechas fueron usadas como control. En ambos grupos, la supervivencia de las CGR disminuye con el tiempo post-lesión pero lo hace con mayor rapidez en el grupo tratado con vehículo. De hecho, el número de CGR fue significativamente mayor en el grupo tratado con BDNF comparado con el tratado con vehículo, a todos los tiempos (7, 9 y 12 días), y esto se observa con ambos marcadores, FG y Brn3a. Es más, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el número de CGR Brn3a+ o FG+ a ninguno de los tiempos analizados, dentro de un mismo grupo. Estos datos indican que la expresión de Brn3a se mantiene en las CGR lesionadas siempre y cuando estén vivas. Finalmente, en los mapas de isodensidad de las CGR Brn3a+ se observo que la pérdida de CGR es homogénea en la retina y que una única inyección intravítrea de BNDF protege las CGR a lo largo de toda la retina. Analizar y comparar el curso temporal de pérdida de las CGR y la activación de caspasa 3 después de corte (SNO) o aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en ratón. Evaluar la supervivencia de las CGR y la activación de la caspasa 3 tras la administración de BDNF o ZDEVD_fmk. Se utilizó como modelo el ratón adulto albino. Se realizaron varios grupos: i/ SNO, o ApNO; ii/ SNO + tratamiento con BDNF, iii/ SNO + tratamiento con el inhibidor de la caspasa 3, ZDEVD_fmk. Las retinas fueron analizadas de 1 a 10 días después de la lesión, y en todas se cuantifico el número de CGR Brn3a+ y de CGR que expresan caspasa 3 activa (CGR a-caspasa 3+). La pérdida temporal de CGR y la aparición de CGR a-caspasa 3+ es la misma después de SNO o ApNO. La pérdida de CGR se produce en dos fases exponenciales, una rápida y una lenta. Durante los primeros 7 días se pierde un 65% de CGR, desde el día 8 al 10 la pérdida es más lenta con un muerte adicional del 4% de las CGR. La aparición de CGR a-caspasa 3+ es Gaussiana, alcanzando su pico máximo a los 4 días de la lesión, disminuyendo a partir de entonces. La expresión de Brn3a disminuye cuando las CGR empiezan a expresar a-caspasa 3, y esto se revierte por el tratamiento con BDNF o ZDEVD_fmk. La tasa de rescate de las CGR de ambos tratamientos es la misma y ambos retrasan la pérdida de CGR en un día. Un tratamiento tardío con ZDEVD_fmk no rescata CGR y varias inyecciones (a 0, 2 y 4 días tras la lesión) no son más eficaces que una sola en el momento de la lesión. Tanto la pérdida de CGR como la aparición de CGR a-caspasa 3+ es uniforme por toda la retina. Analizar, en ratón, la supervivencia de las CGR que expresan Brn3a o melanopsina a largo plazo después de SNO o ApNO y estudiar la degeneración de los axones intrarretinianos de las CGR. Para llevar a cabo este objetivo, se utilizó como modelo el ratón adulto albino. Un grupo fue sometido a SNO y otro a ApNO. Las retinas se analizaron a tiempos crecientes tras cada lesión (de 3 a 90 días) y se analizaron las CGR Brn3a+, CGR m+, CGR pNFH+ y los axones de las CGR intrarretinianos. El número medio de CGR Brn3a+ y de CGR m+ en las retinas intactas y en las contralaterales a la lesión no fue diferente, indicando que la axotomía unilateral no causa muerte de CGR en las retinas no lesionadas. En cambio, el número de somas CGR pNFH+ en las retinas contralaterales fue estadísticamente mayor que en las retinas intactas. En retinas lesionadas la pérdida significativa de CGR ocurre a los 3 días y progresa exponencialmente hasta los 15 días momento en el cual sobrevive un 20% de CGR Brn3a+ y un 26% de CGR m+. Desde los 15 a los 90 días, el porcentaje de CGR m+ se mantiene constante, sin embargo dentro de la población Brn3a+ hay un descenso gradual, de manera que sólo 5% de CGR Brn3a+ sobreviven a este último tiempo. Las CGR pNFH+ se observan a partir del día 3, y su número aumenta progresivamente hasta los 5 días, cuando alcanzan su máximo. A partir del día 5 empieza a decrecer gradualmente el número de somas pNFH+, de manera similar a la activación de la caspasa 3. La degeneración axonal es más lenta que la pérdida de CGR. De hecho, la pérdida de axones se observa a los 14 días, momento en el que sólo sobreviven 22% de CGR. Sin embargo los síntomas de degeneración axonal comienzan a ser visibles ya a los 3 días tras la axotomía (CGR pNFH+). Finalmente, no se observó diferencia en ninguno de los parámetros analizados entre la sección y el aplastamiento del nervio óptico. Conclusiones 1. La expresión de Brn3a se mantiene en CGR vivas, independientemente de la lesión axonal, por lo que el Brn3a es un buen marcador de CGR tanto para estudiar su pérdida como para analizar el efecto neuroprotector de distintas terapias. 2. En rata y en ratón, la muerte de CGR tras axotomía es homogénea y afecta a toda la retina. 3. En ratón, el aplastamiento y la sección del nervio óptico inducen el mismo curso temporal de pérdida de CGR, activación de caspasa 3, aparición de somas pNFH+ y degeneración de los axones intrarretinianos. 4. La pérdida de CGR es significativa al tercer día tras la lesión y progresa en dos fases una rápida hasta los 7 días y una lenta desde los 8 días en adelante, por lo que la ventana terapéutica es muy estrecha (estos datos son clave para planear estrategias de neuroprotección). 5. El BDNF y el inhibidor de la caspasa 3 ZDEVD_fmk producen la misma tasa de rescate de las CGR tras la axotomía. Ambos retrasan el comienzo de la degeneración en 1 día. 6. Un tratamiento tardío con ZDEVD_fmk no rescata las CGR y varias inyecciones no son más eficaces que una sola en el momento de la lesión. 7. La axotomía a largo plazo no causa muerte de CGR en la retina contralateral a la lesión en el ratón albino. 8. La respuesta de la población general de CGR (Brn3a+) y la subpoblación que expresa melanopsina a la axotomía es diferente, siendo el porcentaje de supervivencia de esta última significativamente mayor. 9. La expresión de pNFH en los somas de las CGR es un evento temprano de degeneración neuronal que sigue un curso similar al de la activación de caspasa 3. 10. En ratón, como en rata, la pérdida axonal es más lenta que la pérdida de los somas neuronales. SUMMARY Objectives - To investigate whether the expression of Brn3a after optic nerve axotomy is lost because the RGCs die or because of the axonal injury, independently of the RGCs being still alive. - To analyze and compare the temporal course of RGC loss and the activation of caspase 3 after optic nerve transection (ONT) or crush (ONC) in mice. To evaluate the survival of RGC and activation of caspase 3 after administration of brain derived neurotrophic factor (BDNF) or a caspase 3 inhibitor (ZDEVD_fmk). - To analyze, in mice, the long term survival of the general RGC population (Brn3a+RGCs) and the melanopsin expressing subpopulation (m+RGCs) to ONT or ONC. To study the degeneration of RGC intraretinal axons. Material and methods Animals: In this thesis, we have used adult, albino female rats (Sprague-Dawley, 180-200 g, body weight) and adult, albino male mice (Swiss, 30-32 g body weight). All experimental procedures were carried out in accordance with the Association for Research in Vision and Ophthalmology and the European Unión Guidelines for the Use of Animals in Research and were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia (Spain). Animals subjected to surgery were anaesthetized with a mixture of xylazine (10 mg/kg body weight; ) and ketamine (70 mg/kg body weight) administered intraperitoneally (i.p.). All animals were sacrificed with an i.p. overdose of 20% pentobarbital (0.5-1 ml). Optic nerve lesion. In all instances the injury was performed to the left optic nerve. Optic nerve transection (ONT, in rats and mice) or optic nerve crush (ONC, in mice) were done at 0.5mm from the optic head. Retinas were analyzed at increasing time points after the injuries (from 1 to 90 days, n=4-8 per injury, time point and species). As control, we used retinas from intact animals or the right retinas, contralateral to the injured ones. Intravitreal injection. The following products were administered: BDNF (5 ?g in rat, 2.5 ?g in mice), the irreversible caspase 3 inhibitor, ZDEVD_fmk (125 ng/injection, in mice) and the corresponding vehicles. As a rule, a single injection was done just after the optic nerve injury. Regarding ZDEVD_fmk several additional groups were prepared, to which the injection was performed 2 days after the lesion, or they received multiple doses. To discard the possible toxicity of this inhibitor, this was tested in intact retinas. Retinas were analyzed at increasing time points after the treatment (from 3 to 14 days, n=4-6/group). Retinal processing and dissection: For western blot analysis, retinas were fresh dissected an immediately frozen. For anatomical studies, animals were perfused with paraformaldehyde and the fixed retinas dissected as flat mounts. Immunodetection: Primary antibodies: i/ goat anti-Brn3a to identify the general RGC population; ii/ rabbit anti-melanopsin, to identify the m+RGC subpopulation; iii/ rabbit anti-cleaved caspase 3 (active caspase 3) to detect cells in apoptosis; and iv/ mouse anti-pNFH (RT-97 clone) to identify the intraretinal RGC axons. Secondary detection was done with the appropriate antibodies coupled to Alexa 488 or Alexa 594 fluorophores. Image acquisition: All retinas were photographed under an epifluorescence microscope equipped with a computer-driven motorized stage controlled by Image-Pro Plus (IPP 5.1; Media Cybernetics). Retinal multiframe acquisitions were photographed in a raster-scan pattern in which frames were captured side-by-side with no gap or overlap between them with a 20x objective. Single frames were focused manually before acquisition of the image. All frames from each retina (140-154 acquisitions/retina) were then fed into the IPP image analysis program, to tile them and reconstruct the retinal photomontages. Quantification: The total number of traced RGCs in control retinas, and Brn3a+RGCs in control and injured retinas was automatically quantified with the Image-Pro Plus program using a computerized method developed in our lab. In the injured retinas, the number of traced-RGCs was inferred from manual counting of 12 retinal samples, since the presence of transcellularly labelled microglial cells impairs the automated routine. To achieve this, a new semi-automated macro was validated in control retinas. m+RGCs, c-caspase 3+RGCs, and the somas of pNFH+RGCs were dotted on the retinal photomontage and their number automatically quantified using the Image-Pro Plus program. Topography: To determine the spatial distribution of FG+RGCs and Brn3a+RGCs isodensity maps were used. The distribution of m+RGCs, c-caspase 3+RGCs and pNFH+RGCs was visualized using neighbor maps. These maps were constructed with SigmaPlot (SigmaPlot¿11, Systat Software). Statistics: Statistical and regression analyses were carried out using SigmaStat (Systat Software) or GraphPad Prism 5 (GraphPad Software) programs. Differences were considered significant when p<0.05. Results To investigate whether the expression of Brn3a after optic nerve axotomy is lost because the RGCs die or because of the axonal injury, independently of the RGCs being still alive. For this objective the animal model was the albino rat. Two experimental groups were done. A week before the optic nerve lesion, RGCs were traced from the SC with FG. After this week the left optic nerve of all animals was transected (ONT). In the first group a single injection of 5 µg of BDNF was administered right after the ONT, the second group received the same volume of vehicle. Retinas were analyzed at 2, 9 and 12 days after the lesion (n=6-8/ time point and treatment. Right retinas were used as controls. In both groups the number of surviving RGCs decreases with the time post-lesion, but this decrease is quicker in the vehicle-treated group. In fact, the number of RGCs was significantly higher in the BDNF treated group at all time points (7, 9 and 12 days), and this is observed with both markers, FG and Brn3a. Furthermore, there were not significant differences in the number of Brn3a+RGCs or FG+RGCs at neither of the analyzed time points within the same group. These data indicate that the expression of Brn3a is maintained in injured RGCs as long as they are alive. Finally, Brn3a+RGC isodensity maps show that the loss of RGCs is homogeneous across the retina and that a single intravitreal injection of BDNF protects the entire retinal surface.