Canales de calcio de las celulas glomicas y su modulacion por dopamina

Resumen

El presente trabajo se centra en el estudio de los canales de Ca2+ de alto umbral y de su modulación metabólica y por neurotransmisores. Los experimentos se han realizado en células quimiosensoras del cuerpo carotídeo debido a dos razones fundamentales: a) la electrofisiología de estas células se ha estudiado recientemente en nuestro laboratorio y resultados preliminares han mostrado que poseían una población bastante homogénea de canales de Ca2+ de alto umbral; b) la liberación de dopamina por las células glómicas depende del Ca2+ extracelular y en muchos aspectos esta estructura representa un modelo de acoplamiento excitación-secreción muy similar al de los terminales persinápticos. Por lo tanto, esta preparación parece adecuada para una caracterización biofísica y farmacológica de los canales de Ca2+ de alto umbral y para comprobar si, como ocurre en terminales persinápticos y otros sistemas secretores, existe autoregulación en el mecanismo de secreción. El abordaje experimental de estos objetivos obligó a establecer una situación en la que el registro de la corriente de Ca2+ fuese estable, lo que condujo al estudio de los factores metabólicos de los que depende la presencia en la membrana de canales de Ca2+ funcionales. OBJETIVOS ESPECIFICOS: a) Registro de corrientes iónicas totales y potenciales de acción con la técnica de “patch-clamp” en células tipo I dispersas y mantenidas en cultivo primario. b) Aislamiento experimental de la corriente de Ca2+ y caracterización electrofisiológicas de la misma. c) Clasificación de la corriente de Ca2+ en base a sus propiedades biofísicas y farmacológicas y realización de un estudio comparativo con corrientes de Ca2+ de neuronas y células secretoras. d) Análisis de los factores metabólicos de los que depende el mantenimiento de canales de Ca2+ funcionales, con especial atención a la influencia de la activación de fosfatasas y quinasas citosólicas que regulan el estado de fosforilación de estos canales iónicos. e) Estudio de la modulación de la corriente de Ca2+ por dopamina y noradrenalina y de los posibles mecanismos moleculares implicados en su acción. CONCLUSIONES: 1.- En el presente trabajo se ha estudiado la corriente de Ca2+ de células tipo I del cuerpo carotídeo de conejo dispersas en cultivo primario utilizando la configuración de célula completa (“Whole-cell”) de la técnica de “patch-champ”. 2.- Las células glómicas poseen canales iónicos voltaje-dependientes específicos para Na+, K+ y Ca2+, son excitables y generan potenciales de acción espontáneamente con un componente de calcio. 3.- Las células tipo I poseen una población homogénea de canales de Ca2+ de alto umbral o de activación rápida que se inactivan lentamente dependiendo de Ca2+ extracelular. La cinética de activación de la corriente de Ca2+ depende del potencial de membrana y su cinética es rápida y se ajusta a una función exponencial sencilla en la mayoría de las células estudiadas. 4.- La sustitución del Ca2+ extracelular por Ba2+ produce un aumento en la conductancia de los canales de Ca2+ y modificaciones en sus características cinéticas. Cuando se usa Ba2+ como transportador de carga la relación corriente-voltaje y la curva conductancia-voltaje se desplaza unos 15mV hacia voltajes más negativos. La inactivación observada en presencia de Ca2+ extracelular desaparece cuando se sustituye por Ba2+, y con este ion la cinética de cierre de la corriente de Ca2+ es más lenta. 5.- Los metales de transición Cd2+, Co2+ y Ni2+ añadidos al medio extracelular a concentraciones μM actúan como bloqueantes de la corriente de Ca2+, siendo el efecto reversible con Cd2+ y Ni2+ y no así con Co2+. La potencia relativa de bloqueo es Cd2+ > Ni2+ ≈ Co2+. 6.- Las dihidropiridinas inhiben de forma selectiva la corriente de Ca2+ sin modificar la corriente de Na+ ni de K+. La nifedipina en el rango μM reduce la ICa de forma potente, reversible y dependiente de VM, y acelera el curso temporal de la activación, sin alterar la cinética de cierre. La elgodipina (una dihidropiridina de reciente aparición) a concentraciones nM disminuye la Ica reversiblemente. Su efecto no depende del potencial y no modifica las características cinéticas ni los parámetros voltaje-dependientes de la corriente de Ca2+. La elgodipina en el rango 10-11M tiene actividad agonista sobre la ICa, que aumenta de forma reversible de forma similar a la descrita en otras dihidropiridinas. 7.- La corriente de Ca2+ de las células glómicas tiende a desaparecer rápidamente cuando se registra en el modo “whole-cell”. Este fenómeno se denomina “lavado de la corriente”, es específico de la ICa (no se observa en INa ni en IK) y se debe a la pérdida de constituyentes moleculares del citosol al dializarse por la solución salina de la micropipeta. La corriente de Ca2+ está sujeta a una importante regulación metabólica que determina el estado funcional de los canales de Ca2+. Con una concentración de Cai del orden nM el lavado de la corriente es muy rápido, y se enlentece añadiendo EGTA o BAPTA en la solución interna. La presencia de ATP y AMPc y quelantes de calcio retrasa el proceso de lavado. La subunidad catalítica de la proteína quinasa A interviene en el control metabólico de la corriente de Ca2+ junto con ATP y AMPc produciendo en último término la fosforilación de los canales de Ca2+ y manteniendo de este modo su integridad funcional. Nuestros datos muestran que la inactivación y el lavado de la corriente son fenómenos cuya base molecular es distinta. 8.- La triflúorperacina (un agente que inactiva los procesos que dependen de Ca2+/calmodulina) retrasa el lavado de ICa indicando la existencia de fosfatasas intracelulares que regulan la actividad de los canales de Ca2+ favoreciendo su desfoforilación. El mantenimiento de canales de Ca2+ funcionales depende por tanto del equilibrio en la actividad de quinasas y fosfatasas intracelulares. 9.- La dopamina, que es un transmisor secretado por las células glómicas, inhibe de forma selectiva y reversible la corriente de Ca2+. El efecto es rápido y se consigue con un amplio rango de concentraciones, entre 10-12 y 10-5 M. La dopamina no modifica los parámetros cinéticos voltaje-dependientes de la I­­Ca y su acción es independiente del potencial de membrana. La disminución de la corriente de Ca2+ por dopamina es mayor a concentraciones bajas (nM y pM) que altas (μM) y en aplicaciones prolongadas el efecto inhibidor de la ICa se atenúa conforme transcurre la exposición al transmisor. Esta desensibilización es más evidente a bajas concentraciones de DA. Las exposiciones repetidas a DA producen un efecto cada vez menor y una desensiblización más lenta. Estas observaciones se pueden explicar mediante un modelo simplificado que asume varios estados funcionales del completo ligando-receptor. 10.- La presencia de análogos no hidrolizables del GTP en la solución interna de registro hace que el efecto de DA sobre la corriente de Ca2+ sea irreversible. Puesto que se ha descrito la participación directa de proteínas con actividad GTPasa en la modulación de canales iónicos de otras células, se sugiere un mecanismo similar para el efecto de la DA sobre la corriente de Ca2+ de las células glómicas. 11.- La noradrenalina actúa de forma similar a la DA sobre la corriente de Ca2+ pero con un efecto menos potente. La inhibición por NA de la ICa es reversible y el efecto se observa al aplicar el transmisor repetidamente. 12.- La inhibición de la corriente de Ca2+ por catecolaminas forma parte de un mecanismo de regulación de la secreción en las células tipo I donde la respuesta quimiosensora se modula por los propios productos de secretados. Este sistema de autoregulación de la actividad secretora de las células glómicas es muy sensible, está sujeto a desensibilización y es similar al descrito en otras preparaciones, como por ejemplo la inhibición presináptica por receptores α-adrenérgicos. El papel fisiológico de la autorregulación por dopamina puede ser importante no sólo a nivel celular limitando la respuesta secretora a estímulos de hipoxia extrema, sino que también, desde un punto de vista sistémico, posiblemente contribuye a la adaptación que se observa durante exposiciones prolongadas a bajas presiones parciales de O2.