Sistema para la adquisición, almacenamiento y análisis de corrientes iónicas transmembrana

Resumen

El objetivo general del presente trabajo ha sido el diseño e implementación de un sistema automatizado para el control del potencial de membrana y la adquisición, almacenamiento, representación en pantalla y análisis de corrientes iónicas generadas en la membrana de células mantenidas en cultivo. El sistema, construido sobre un ordenador personal, es de una gran rapidez y versatilidad y permite su adaptación para el registro y medida en tiempo real de cualquier fenómeno celular que pueda convertirse en una señal eléctrica. El diseño e implementación del sistema se ha llevado a cabo no sólo para satisfacer los requerimientos técnicos necesarios en la investigación biofísica de nuestro laboratorio, sino que el desarrollo del "hardware" y "software" propios ha sido uno de los objetivos del trabajo. De esta forma se ha conseguido una independencia tecnológica y potenciado la calidad de la investigación y la capacidad de análisis que son críticas para llevar a cabo una investigación competitiva en biofísica celular. Los objetivos específicos del trabajo han sido los siguientes: 1) Diseño e implementación de un generador de pulsos programable necesario para modificar el potencial de membrana con pulsos únicos o con secuencias de pulsos con intervalos variables y polaridad, amplitud y duración seleccionables según los requerimiento experimentales. 2). Diseño y construcción de un sistema de adquisición basado en la conversión digital de las señales de corrientes iónicas transmembrana generadas por los cambios del potencial de membrana al aplicar los pulsos referidos en el párrafo anterior. La velocidad de adquisición (de 20 a 200 µs por muestra) se modifica por programa y una secuencia de muestras (formada por 500 puntos cada uno con resolución de 12 bits) se almacenan en memoria RAM del ordenador o en un disco duro. 3) Diseño y construcción de un sistema de conversión digital/analógico de secuencias de muestras almacenadas en RAM o en disco duro del ordenador para su representación en la pantalla de un osciloscopio. Al generar el ordenador la señal de barrido del osciloscopio y representar la secuencia de muestras a una frecuencia superior a 20 Hz se convierte un osciloscopio normal en otro digital con una flexibilidad superior a los osciloscopios digitales existentes. Mediante un segundo canal del osciloscopio se presentan también en pantalla funciones matemáticas (exponenciales, derivadas, etc.) generadas en el propio ordenador. 4) Desarrollo del programa ANALA, escrito en Basic y en Lenguaje Ensamblador, que controla los elementos del "hardware" indicados anteriormente y que almacena todas las variables experimentales. Mediante diferentes subrutinas este programa realiza el análisis de las señales almacenadas. El análisis se centra fundamentalmente en: medida automática de parámetros (amplitud, duración, intervalos, etc); confección de diagramas para observar la relación entre dos parámetros; sustracción y promediado de señales; ajuste lineal y exponencial de partes de la señal registrada; integración y diferenciación de la señal; medida automática de capacidad y tamaño de las células; cálculo de la resistencia en serie. 5) Ajuste y comprobación del funcionamiento de cada una de las partes del sistema t en su conjunto utilizando un circuito RC paralelo, equivalente desde el punto de vista eléctrico a la membrana celular, y el registro de corrientes de K+ en células adrenocorticales en cultivo mediante la técnica de "patch-clamp".