Nuevas técnicas electroquímicas para la determinación de la capacidad antioxidante en extractos alimentarios basadas en el método cuprac

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis La mayoría de las reacciones que ocurren en la naturaleza son producidas por reacciones redox, en las cuales hay una transferencia de electrones entre especies químicas. Las reacciones de óxido-reducción son biológicamente relevantes para el metabolismo de todos los seres vivos, ya que éstos obtienen la mayor parte de su energía a partir de ellas, como son por ejemplo la fotosíntesis y el metabolismo aeróbico. Aunque el oxígeno es imprescindible para la vida, también puede ser el propulsor de diversas enfermedades debido a una producción incontrolada de radicales libres, entre los que se encuentran las especies reactivas de oxígeno (ROS: “Reactive Oxygen Species”). Las ROS son moléculas muy pequeñas altamente reactivas debido a sus electrones desapareados. Estas especies se forman de manera natural como subproducto del metabolismo del oxígeno y tienen un importante papel en la señalización celular, pero en épocas de estrés ambiental sus niveles pueden aumentar mucho, rompiendo el equilibrio y provocando daños significativos a las estructuras celulares, provocando una situación conocida como estrés oxidativo. El daño causado por el estrés oxidativo depende principalmente de la reactividad del radical libre y la disponibilidad de un sustrato cercano al lugar donde se lleva a cabo la formación de los radicales libres. Al producirse un aumento de radicales libres, se origina un estado oxidante que repercute sobre el sistema redox de la propia célula, causando graves daños en gran número de biomoléculas como lípidos, proteínas, glúcidos y ácidos nucleicos impidiendo su correcto funcionamiento. Por otro lado, aunque los radicales libres sean conocidos por sus efectos dañinos sobre el organismo, también son necesarios para el correcto funcionamiento celular, ya que las células necesitan estar rodeadas de un ambiente oxidativo para poder llevar a cabo sus funciones biológicas. Para ello, los organismos poseen mecanismos de defensa antioxidantes para prevenir, retrasar o detener la producción de radicales libres. Sin embargo, cuando hay un aumento considerable de la velocidad de formación de ROS con respecto a las condiciones normales, se origina como consecuencia una disminución de los mecanismos propios de defensa, derivando en una situación de desequilibrio entre las especies oxidantes y las antioxidantes. El desequilibrio redox originado se puede relacionar con más de un centenar de enfermedades: procesos patológicos como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Crohn, ciertos tipos de cáncer o diabetes mellitus; patologías cardiovasculares como ateroesclerosis; procesos reumáticos, patologías gastroentéricas y afecciones broncopulmonares. También los procesos fisiológicos como el envejecimiento, el daño causado por el ejercicio físico agotador, etc. El balance entre los agentes oxidantes y antioxidantes determina el estado redox, manteniéndose una “homeostasis redox” o estado de equilibrio de las condiciones de oxidación-reducción finales. Aunque es difícil evitar la formación de radicales libres, sí es posible minimizar los efectos negativos que afectan al organismo. Para ello, es necesario un aumento en los niveles de antioxidantes para lograr un equilibrio en el sistema celular. Los antioxidantes son sustancias que presentes en concentraciones bajas, en comparación con el sustrato oxidable, retrasan significativamente o evitan la oxidación de éste. Dependiendo de la interacción de los antioxidantes con los sustratos oxidantes, los antioxidantes pueden ser de tipo I, II, III, según se lleve a cabo: el impedimento de formación de radicales libres, la interrupción de la propagación de radicales libres o desplazamiento de las ROS, y la reparación del daño causado por los radicales libres o eliminación de las moléculas que se han estropeado, respectivamente. En los últimos años ha habido un gran interés por la investigación de antioxidantes de origen natural frente a los de origen sintético, siendo también de gran interés el desarrollo de productos cosméticos enfocados principalmente en el tratamiento del envejecimiento cutáneo. El consumo de antioxidantes naturales frente a los sintéticos está mucho más aceptado y demandado comercialmente por la población, siendo su consumo un refuerzo de las defensas naturales propias del organismo. El gran interés del uso de antioxidantes naturales se debe principalmente al gran número y variedad de productos fitoquímicos con elevado poder antioxidante, los cuales se encuentran en la mayoría de los alimentos, llegando así a suprimir el consumo crónico de antioxidantes sintéticos presentes en gran variedad de bebidas y alimentos. El consumo de antioxidantes naturales ofrece beneficios frente a las evidencias toxicológicas a largo plazo de los antioxidantes sintéticos, relacionadas directamente con la formación de radicales libres. La seguridad que presentan los productos fitoquímicos hace que la población tenga más confianza en ellos. La determinación de la actividad antioxidante de compuestos puros resulta imprescindible para conocer la protección frente a la oxidación o el deterioro del alimento que lo alberga en su composición. Además de que estos antioxidantes se encuentran en diferentes proporciones, no se encuentra uno solo en cada alimento, sino que lo más normal es encontrar mezclas de diferentes compuestos antioxidantes, y cada uno con una capacidad diferente, lo que dificulta la tarea. Hay una necesidad de adquirir métodos unificados estandarizados que permitan servir de protocolo para una correcta aplicación del ensayo, comparar los resultados entre alimentos o productos comerciales, su aplicación útil como herramienta en el control de calidad, así como proveer de estándares para la regulación y las declaraciones de efectos en la salud. De manera adicional, debe exigirse el cumplimiento de otros requisitos como instrumentación fácilmente accesible, alta sensibilidad, alta reproducibilidad, simplicidad, rapidez y bajo coste, entre otros. En los últimos años, los métodos espectrofotométricos han adquirido cierta repercusión en el análisis in vitro de la capacidad antioxidante de muestras biológicas y extractos vegetales, pero presentan limitaciones debidas a la coloración en las muestras o del producto de reacción o a la precipitación del producto de reacción, provocando un aumento de la turbidez de la muestra que da lugar a errores por defecto o exceso. Además, para los compuestos inestables, un tiempo de incubación relativamente alto impide la determinación de la capacidad antioxidante. Para CUPRAC, el pH de trabajo es de 5.5 y se necesitan grandes cantidades de disolvente no acuoso (etanol) para disolver a la neocuproína, por lo que su principal limitación se debe a las condiciones no fisiológicas utilizadas. La sencillez y el bajo coste asociado a diversas técnicas electroquímicas ha demostrado que son una alternativa válida para evaluar el poder antioxidante pudiéndose realizar las medidas a pH fisiológico. En general, los compuestos antioxidantes actúan como agentes reductores y tienden a ser fácilmente oxidados sobre la superficie de un electrodo. En base a este hecho, se establece una relación intrínseca entre el comportamiento electroquímico del compuesto antioxidante y su consiguiente actividad antioxidante. El objetivo principal de la memoria es desarrollar estrategias electroquímicas para la determinación de la capacidad antioxidante (CAO), basadas en las reacciones de oxidación-reducción del cobre, que permitan sustituir el método CUPRAC, evitando la presencia de neocuproína y, por tanto, utilizando condiciones de trabajo más cercanas a las fisiológicas. Estas metodologías se aplican al estudio de los extractos en medio acuoso y etanólico de los frutos de plantas del género Capsicum y cáscaras de cítricos, muy utilizados en alimentación y cosmética. 2. Contenido de la investigación Para abordar el objetivo de la tesis, en primer lugar, se ha desarrollado un método electroquímico para la determinación de la capacidad antioxidante (CAO) en muestras coloreadas con el método CUPRAC en ausencia de neocuproína, con ventajas frente a los métodos espectrofotométricos. Para evitar las limitaciones que presentan los métodos espectrofotométricos (pH, uso de disolvente no acuoso, baja fuerza iónica y elevado tiempo de incubación) se utiliza un electrodo como indicador para reemplazar la neocuproína, relacionando así las interacciones antioxidantes-intermedios producidos en la reducción de Cu (II), con la capacidad antioxidante. Se optimizan diversos parámetros. La limpieza del electrodo se ha conseguido mediante el uso de mezcla crómica diluida, agua regia, pasta de diamante y dos tipos de alúminas permitiendo conseguir una buena reproducibilidad del Cu (II) mediante voltametría de onda cuadrada, utilizando para ello una ventana de potencial de +0.3 V a –0.3 V, un potencial de paso de 2 mV, una amplitud de pulso de 20 mV y una frecuencia de 25 Hz. De los resultados obtenidos, debido a la reducción de los antioxidantes, se observan picos adicionales en los voltagramas de onda cuadrada interfiriendo en la medida de la interacción antioxidantes-Cu (I). Por esta razón, al realizar la validación del método mediante voltametría de onda cuadrada de barrido inverso con distintos antioxidantes, ácido gálico, ácido ascórbico y Trolox, se consigue evitar la reducción de éstos, provocando la disminución de la señal de reducción de Cu (II) generados en el barrido de oxidación, siendo un método útil para la determinación de CAO obteniéndose valores en la misma relación que las obtenidas mediante CUPRAC. Además, se han desarrollado electrodos más simples y robustos para la determinación de la medida de la capacidad antioxidante global de mezclas y no solo de compuestos puros. Para ello se han preparado electrodos basados en la electrodeposición de partículas metálicas catalíticas de cobre y en la electrodeposición de un polímero conductor (PANI) en el que se depositarán nanopartículas de cobre sobre carbón vitrificado. Se llevan a cabo estudios de reproducibilidad y repetitividad en ambos electrodos, obteniendo una estabilidad de 10 y 20-30 medidas para los electrodos de cobre y polímero-cobre, respectivamente. En este caso, las capacidades antioxidantes están en la misma relación que las obtenidas por el método CUPRAC y CUPRAC con detección electroquímica, por lo que se trata de un método alternativo a CUPRAC. Una vez desarrollados los electrodos, se caracterizan las superficies electródicas modificadas mediante “Microscopía de Barrido Electrónico (SEM) para conocer la morfología y la distribución de las nanopartículas metálicas y polímero. De los resultados obtenidos, se concluye que, al aumentar el tiempo de electrodeposición las partículas de metal forman aglomerados de mayor tamaño. En cambio, para los electrodos de polímero-cobre se forma una estructura de fibras, con huecos en los que se depositan las nanopartículas de cobre, las cuales se alojan en el electrodo bajo el polímero, quedando así protegidas. Por otra parte, se ha estudiado la correlación entre la energía de los orbitales HOMO y los valores de pK de disociación de los ácidos dihidroxibenzoicos (DHBA) y de los dihidroxibenzaldehídos (DHB) mediante técnicas electroquímicas y espectroscópicas, estableciendo una relación de sus propiedades y estructuras químicas. Los resultados obtenidos indican que la mayoría de los procesos de oxidación de la mitad de los aldehídos y ácidos son reversibles o cuasireversibles, siendo irreversibles para el resto, resultando ser especies no disociadas cuando los valores de pH son menores que el pK, mientras que si el pH es mayor que el pK se corresponde a las especies disociadas. También se muestra que las diferencias de los potenciales de pico de las especies disociadas y no disociadas consiguiendo buenas correlaciones con los valores de pK, existiendo así una relación entre estructura y reactividad química. Por último, se han determinado las capacidades antioxidantes utilizando los métodos electroquímicos propuestos a lo largo de la tesis, comparando con técnicas espectrofotométricas (ensayos CUPRAC y DPPH) donde las condiciones de trabajo están lejanas a las fisiológicas. Mediante el método e-CUPRAC se consigue mejorar las condiciones de trabajo, minimizando el tiempo de medida, usando un pH de trabajo cercano al fisiológico y también un medio acuoso. Por último, mediante voltametría de pulso diferencial, y haciendo uso de un electrodo de carbón vitrificado, se han determinado la pungencia y el contenido en ácido ascórbico para extractos acuosos y etanólicos de plantas del género Capsicum. Además, se determina el ácido ascórbico en extractos de cáscaras de cítricos, resultando ser un método sencillo, rápido y barato. La presencia de capsaicina se observa en los extractos etanólicos de pulpa y semillas de los diferentes chiles picantes en estudio, siendo las semillas del chile Jolokia el que presenta mayor valor de pungencia (4.2·103 SHU). Mientras que el contenido de ácido ascórbico es observable en los extractos acuosos y etanólicos de la pulpa de los chiles picantes, donde el extracto de pulpa de Chile Piri-Piri en etanol (20660 ppm) presenta el valor más elevado. En comparación con los cítricos, el contenido en ácido ascórbico en pimientos es mucho más elevado. Tanto en los extractos de pimientos como en las cáscaras de cítricos, se determina la capacidad antioxidante por técnicas espectroscópicas y electroquímicas, realizando una comparativa entre ellos. En el estudio de la CAO es de gran importancia la naturaleza de las moléculas que forman parte de los extractos, debido a las interacciones entre antioxidantes se pueden ver influenciadas por interacciones sinérgicas o antagónicas, considerando también su concentración y la reactividad hacia las especies radicálicas. Se concluye que las capacidades antioxidantes obtenidas por las diferentes técnicas varían de forma similar, aunque, hasta la fecha, no existen métodos unificados para llevar a cabo la medida de la capacidad antioxidante, principalmente debido a la gran desigualdad de las condiciones en las que se desarrollan las diferentes metodologías, además de la complejidad y diversidad que puede presentar la matriz en estudio. 3. Conclusión 1. El método CUPRAC con detección electroquímica, que hace uso de un electrodo como indicador para reemplazar la neocuproína, permite medir la capacidad antioxidante de la misma manera que lo hacen los métodos espectrofotométricos CUPRAC y DPPH. 2. El método propuesto presenta ventajas frente a los espectrofotométricos: las mediciones no se ven afectadas por exceso o defecto debido al color de las muestras o al producto de la reacción (o ambos) y, además, se llevan a cabo en condiciones cercanas a las fisiológicas con alta fuerza iónica y en ausencia de disolventes no acuosos. 3. Las condiciones óptimas para la limpieza del electrodo de carbón vitrificado (ECV) para la mejor reproducibilidad se obtiene mediante el uso de mezcla crómica diluida, agua regia, pasta de diamante y dos tipos de alúminas. 4. Las condiciones óptimas para la reproducibilidad de Cu (II) se consiguen mediante voltametría de onda cuadrada, con una ventana de potencial de +0.3 V a –0.3 V, un potencial de paso de 2 mV, una amplitud de pulso de 20 mV y una frecuencia de 25 Hz. 5. Los resultados obtenidos mediante voltametría de onda cuadrada directa presentan picos adicionales debido a la reducción de los antioxidantes, interfiriendo en la medida de la interacción antioxidantes-Cu (I). En este caso, mediante voltametría de onda cuadrada de barrido inverso se consigue evitar la reducción de los antioxidantes, provocando la disminución de la señal de reducción de Cu (II) generados en el barrido de oxidación. Esta disminución de la señal está relacionada directamente con la capacidad antioxidante. 6. Mediante CUPRAC con detección electroquímica se han podido determinar las capacidades antioxidantes de ácido ascórbico y ácido gálico en condiciones cercanas a las fisiológicas. Estos valores se encuentran en la misma relación que las obtenidas por el método CUPRAC espectrofotométrico, demostrando que el método es útil para la determinación de la capacidad antioxidante. 7. Las condiciones óptimas para la limpieza del electrodo de carbón vitrificado se consiguen con el uso de mezcla crómica diluida, agua regia, pasta de diamante y dos tipos de alúminas. 8. Se han establecido las condiciones óptimas para los electrodos de trabajo, es decir, la electrodeposición del cobre, la electrodeposición del polímero y la electrodeposición de nanopartículas de cobre sobre el polímero. 9. Con objeto de obtener la mayor reproducibilidad posible, se han establecido las condiciones óptimas el acondicionamiento de los electrodos. Para el electrodo carbón-cobre, las señales de oxidación y reducción para barridos sucesivos fueron reproducibles al menos durante 10 medidas, con un 1% de incertidumbre. Para el electrodo polímero-cobre se consiguieron entre 20 y 30 medidas estables. 10. La presencia de un antioxidante provoca la disminución de la señal de reducción debido a la interacción con los iones Cu(II) generados en el barrido de oxidación. Esta disminución de la señal cual está relacionada directamente con la capacidad antioxidante. 11. La microscopía SEM indica que, al aumentar el tiempo de electrodeposición para los electrodos carbón-cobre, las partículas de metal forman aglomerados de mayor tamaño. El acondicionamiento del electrodo no modifica sustancialmente el tamaño y distribución de los aglomerados de partículas de cobre, pero sí su morfología, con formas más globulares. En los electrodos de polímero y cobre el polímero forma una estructura de fibras, con huecos en los que se depositan las nanopartículas de cobre, las cuales se alojan en el electrodo bajo el polímero, quedando así protegidas. Al añadir el antioxidante, éste se asocia en parte a iones Cu (I) o Cu (II) que no se han reducido. 12. Con estos dos electrodos se han medido las capacidades antioxidantes de ácido ascórbico y ácido gálico en equivalentes de Trolox en condiciones cercanas a las condiciones fisiológicas. Estas capacidades antioxidantes están en la misma relación que las obtenidas por el método CUPRAC y CUPRAC con detección electroquímica, lo que indica que ambos electrodos son útiles para la determinación de la capacidad antioxidante como alternativa al método CUPRAC. 13. Los procesos de oxidación de la mitad de los aldehídos y ácidos son reversibles o cuasireversibles, siendo irreversibles para el resto. A valores de pH inferiores al pK de disociación especies oxidables son las especies no disociadas, mientras que a pH superiores al pK son las especies disociadas. 14. Las diferencias de los potenciales de pico las especies disociadas y no disociadas, directamente relacionadas con las diferencias en las energías HOMO, muestran buenas correlaciones con los valores de pK. Esto indica que los potenciales de pico de oxidación en disolución se pueden relacionar con las energías HOMO y que, en consecuencia, hay una relación entre estructura y reactividad química. 15. La mayoría de las técnicas utilizadas pueden determinar la capacidad antioxidante de los DHB y DHBA que no presentan actividad en el método DPPH. CUPRAC, DPPH, CUPRAC con detección electroquímica y e-CUPRAC son sensibles tanto para compuestos puros como en extractos de alimentos. 16. Mediante el método e-CUPRAC se minimiza el tiempo de medida, las medidas se pueden realizar cerca de las condiciones fisiológicas (pH neutro y medio acuoso), resultando ser más ventajoso con respecto al resto de métodos. 17. Se concluye que, hasta la fecha, no existen métodos unificados para llevar a cabo la medida de la capacidad antioxidante, principalmente debido a la gran desigualdad de las condiciones en las que se desarrollan las diferentes metodologías, además de la complejidad y diversidad que puede presentar la matriz en estudio. 18. El uso de voltametría de pulso diferencial con un electrodo de carbón vitrificado permite la determinación simultánea de la pungencia y ácido ascórbico en extractos de frutos del género Capsicum y cáscaras de cítricos. El método es sencillo, rápido y barato, de sensibilidad comparable a otros métodos. 19. Los valores de pungencia más elevados se obtuvieron para los extractos en etanol, debido a la elevada hidrofobicidad de la capsaicina. El mayor valor de pungencia lo presentó el extracto de semillas de Jolokia en etanol (4.2·103 SHU). 20. El contenido de ácido ascórbico más elevado se obtuvo para los extractos de pulpa de Chile Piri-Piri en etanol (20660 ppm) y para los extractos de cáscara del cítrico Faustrime Caviar en etanol (2263 ppm). Por lo general, el contenido de ácido ascórbico en chiles es más elevado que en cítricos. 21. La naturaleza de las moléculas que forman parte de los extractos es un factor determinante de la capacidad antioxidante. En una matriz compleja las interacciones entre antioxidantes se ven influenciadas por interacciones sinérgicas o antagónicas, considerando también su concentración y la reactividad hacia las especies radicálicas. 22. Mediante el método e-CUPRAC se minimiza el tiempo de medida, las medidas se pueden realizar cerca de las condiciones fisiológicas (pH neutro y medio acuoso), pudiendo llegar a medir antioxidantes inactivos en otros métodos. 23. e-CUPRAC es tan sensible como DPPH y CUPRAC para extractos de alimentos. 4. Bibliografía [1] B. Halliwell. 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