Presencia y distribución de neuroreceptores de serotonina, gaba y dopamina en el espermatozoide humano. Estudio con técnicas de microscopía de alta resolución y análisis de grafos

Resumen

Antecedentes Esta es la primera tesis del Proyecto Neurosperm©, elaborado por el Prof. Joaquín de Juan Herrero, director y fundador de la Cátedra de Medicina Reproductiva (2013-2017), de la Universidad de Alicante y el Instituto Bernabeu. Se trata de una nueva línea de investigación sobre la presencia y distribución de neuroreceptores en el espermatozoide humano. Este proyecto tiene dos antecesores: el premio ICIRA Merk-Serono (2010-2011) para el proyecto “Distribución de receptores cannabinoides neuronales (CB1 y CB2) en espermatozoides humanos”; y el premio Q PHARMA financiado por FUNDEUM al mejor proyecto de Biotecnología y Salud para el proyecto “Andros 2050”. Objetivos El proyecto se centra en el estudio, con técnicas de microscopía de alta resolución, análisis multivariante y teoría de grafos, de la presencia y distribución, en la membrana del espermatozoide humano maduro, de ocho neuroreceptores clásicos: cuatro de serotonina, dos de GABA y dos de dopamina. Su interés científico y clínico radica en dos objetivos fundamentales: a) generar un mapa preciso de las zonas de localización, de los ocho neuroreceptores en la superficie del espermatozoide humano, y b) desarrollar un modelo experimental que permita, en el futuro, evaluar los efectos que ejercen diferentes sustancias neuroactivas sobre los neuroreceptores y su relación con diversos trastornos de la salud reproductiva masculina. Diseño y población En este proyecto, se han estudiado muestras seminales de varones voluntarios sanos, de entre 18 y 35 años. Los voluntarios no recibieron ninguna compensación por su participación en el estudio, simplemente se les entregó un informe con los resultados de su seminograma. Tras proporcionarles la información y los medios necesarios para la correcta obtención de las muestras, según el “Manual de laboratorio de la OMS para el examen y procesamiento del semen humano” (World Health Organization, 2010), se les dio un cuestionario sociodemográfico, y se les solicitó cumplimentar un consentimiento informado, que aprobó el Comité de Ética de la Universidad de Alicante. Finalmente, se les asignó una fecha para la entrega de la muestra seminal correspondiente. Material y métodos Una vez realizados los seminogramas y los correspondiente análisis macroscópicos y microscópico, las muestras fueron procesadas para los estudios experimentales. Lo primero fue procesar las muestras de espermatozoides a estudiar: frescas, capacitadas y reaccionadas acrosómicamente. A cada muestra le siguió la fijación específica correspondiente para su posterior estudio con Western Blot o WB, microscopía confocal de barrido laser o LSCM (laser scanning confocal microscopy), microscopía electrónica de barrido de emisión de campo o FESEM (field emission scanning electron microscopy) y microscopía electrónica de transmisión o TEM (transmission electron microscopy). Después del procesamiento inmunocitoquímico las muestras fueron observadas con los citados microscopios. Las imágenes obtenidas permitieron describir la ubicación y distribución de los ocho neuroreceptores en las diferentes zonas de la superficie espermática. Finalmente, utilizando diferentes técnicas estadísticas: estándares, análisis de conglomerados de las variables y teoría de grafos, se realizó un análisis cuantitativo de la cantidad y distribución de los 8 receptores. Resultados y conclusiones Dada la gran cantidad de datos obtenidos en el apartado de Resultados y analizados en la Discusión, aquí solo se presenta una descripción conjunta reducida de ambos en forma de conclusiones. 1. Mediante las técnicas de microscopía de LSCM y FESEM, la taxonomía numérica, el análisis multivariante y las técnicas de grafos, se detecta, confirma, cuantifica y describe, por vez primera la presencia y distribución de ocho neuroreceptores en el espermatozoide humano. Se trata de tres familias clásicas de neurotransmisores: serotonina (5-HT1B, 5-HT2C, 5-HT3A y 5-HT4), GABA (GABAA y GABAB) y dopamina (D1 y D2). 2. Con frecuencia, los términos que describen las regiones de los espermatozoides, con el microscopio de fluorescencia, son ambiguos. En esta tesis, las técnicas LSCM y FESEM han permitido proporcionar una mayor precisión a la hora de describir la localización de estas regiones y sus posibles funciones. 3. La distribución de los neuroreceptores, en la membrana espermática, se caracteriza por ser mucho más densa y agrupada en áreas que hemos denominado circunscritas, concretamente en: la banda anterior (BA) y la banda posterior (BP) de la cabeza y en la pieza terminal (PT) de la cola, definidas en esta tesis. El resto de áreas como la zona anterior (ZA) y la zona posterior (ZP) de la cabeza; y la pieza intermedia (PI) y la pieza principal (PP) de la cola, son áreas en las que la distribución de los neuroreceptores es difusa y laxa. 4. El análisis de conglomerados divide los receptores en dos grandes conglomerados: de tipo I (CI) y de tipo II (CII). El tipo I lo forman cuatro tipos de receptores (5HT1B, D1, GABAA y 5HT4) cuya densidad es muy alta (4 veces más que en CII). El tipo II comprende cuatro tipos de receptores con un número mucho más bajo (5HT3A, D2, GABAB y 5HT2C). 5. El CI tiene tres áreas que hemos denominado circunscritas (BA, BP y PT) cuya densidad de receptores es muy abundante y con tendencia a distribuirse en grupos (receptores sobredispersados) en comparación con las mismas áreas de CII. 6. El espermatozoide tiene cuatro zonas difusas (ZA, ZP, PI y PP) cuya densidad de receptores, en general, es muy inferior a la de las zonas circunscritas. 7. La alta densidad de receptores en las áreas circunscritas (BA, BP y PT) indica, al comparar las características de los neuroreceptores que ocupan cada una de ellas, que son zonas para el procesamiento de señales moleculares. 8. La presencia de diferentes neuroreceptores, en las mismas áreas, nos permite considerarlos como neuroreceptores cooperativos (NRC). Es decir, neuroreceptores que comparten de forma sinérgica la misma ubicación y funciones. 9. Los datos muestran que los receptores situados en las áreas circunscritas participan en las principales funciones a desarrollar por los espermatozoides maduros (hiperactividad, capacitación, reacción acrosómica, etc.). Aquellos ubicados en áreas difusas actuarían creando un medioambiente interno, estable y homeostático. 10. La aplicación de esta metodología es de gran interés para futuros estudios experimentales acerca de la influencia, en los espermatozoides humanos, de los diferentes fármacos empleados en el tratamiento de trastornos neuropsicológicos y también la influencia de otras entidades nosológicas.