Papel de la endonucleasa V en metabolismo de ácidos nucleicos de trypanosoma brucei

Resumen

Trypanosoma brucei es el agente causal de la tripanosomiasis africana, comúnmente llamada “enfermedad del sueño”. Esta enfermedad afecta a 36 países del África subsahariana, y su distribución depende de la presencia del vector de transmisión, la mosca Tse-tsé. Debido al bajo impacto socioeconómico de los afectados es considerada una enfermedad olvidada, ocupando un puesto muy bajo entre las prioridades de salud pública. Gracias a las medidas de control adoptadas en las últimas décadas el número de casos reportados ha caído por debajo de los 3000 durante el año 2015 {Hide 1999; Franco et al. 2014}. No obstante, los fármacos utilizados actualmente para tratar la enfermedad son poco eficaces y presenta una alta toxicidad {Brun et al. 2010}. Conocer la biología de este parásito resulta por tanto fundamental si queremos encontrar nuevos fármacos que nos ayuden a erradicar la enfermedad. El mantenimiento de la integridad genética es vital para la supervivencia de todos los organismos y la continuidad de las especies. T. brucei, en su condición de parásito extracelular obligado, se ve expuesto a condiciones de fuerte estrés oxidativo y nitrosativo. Cuando un huésped mamífero es infectado se activa la respuesta inmune primaria, durante la cual se liberan grandes cantidades de agentes oxidantes y nitrantes que provocan daños en los ácidos nucleicos {Mabbott et al. 1998; Burney et al. 1999}. Las enzimas implicadas en su reparación son fundamentales para la supervivencia de T. brucei, y conocer su funcionamiento nos puede ayudar a elaborar nuevas estrategias para luchar contra la enfermedad. La desaminación de citosina y adenina es una de las lesiones más comunes, y su eliminación recae fundamentalmente en la reparación por escisión de bases (BER) {Krokan and Bjoras 2013}, iniciada por glicosilasas específicas que escinden la base dañada. No obstante, se han descrito rutas de reparación alternativas capaces de eliminar este tipo de lesiones. La endonucleasa V (EndoV) es una endonucleasa que hidroliza el segundo enlace fosfodiéster en 3’ de la lesión. En procariotas se ha descrito un amplio rango de lesiones en DNA susceptibles de ser procesadas por EndoV, aunque parece que uracilo e inosina son los sustratos preferidos por esta enzima {Kuraoka 2015}. No obstante, estudios recientes realizados en células humanas indican que en este organismo el sustrato genuino de EndoV es la inosina en RNA {Morita et al. 2013; Vik et al. 2013}, lo que sugiere una posible implicación en metabolismo de RNA. El objetivo principal de esta tesis ha sido caracterizar la endonucleasa V de T. brucei (TbEndoV). Por un lado, hemos purificado la proteína para determinar su actividad frente a diversos sustratos de DNA y RNA. Nuestros resultados in vitro indican que TbEndoV es principalmente activa frente a sustratos de RNA con contenido en inosina, mientras que la actividad enzimática mostrada frente a sustratos de DNA que contienen uracilo o inosina es prácticamente nula o muy baja. Además, los sustratos con la conformación de tRNAs son procesados eficientemente por TbEndoV cuando la adenina en posición 34 es desaminada a inosina, lo que sugiere un posible papel de esta enzima en la degradación de RNA desaminados o participando en el reciclaje de tRNAs editados. La inactivación de TbEndoV en la forma sanguínea del parásito no tiene un efecto significativo en su capacidad de proliferación in vitro ni en su capacidad infectiva en un modelo murino. En cambio, la supresión de la expresión de TbEndoV provoca un defecto en el crecimiento e impide la progresión normal del ciclo celular de la forma procíclica de T. brucei. Asimismo hemos analizado el papel de TbEndoV en la protección frente a agentes que promueven la incorporación de bases desaminadas en DNA, tanto uracilo como inosina. En células sanguíneas de T. brucei, la endonucleasa V no protege frente a los daños genotóxicos inducidos por exposición a metotrexato, bisulfito de sodio u óxido nítrico, lo que sugiere que esta proteína no tiene un papel relevante en el mantenimiento de la integridad genómica en estas células. No obstante, la sobreexpresión de TbEndoV revierte el fenotipo de sensibilidad a bisulfito de sodio de células sanguíneas deficientes en UNG por lo que en ausencia de la ruta BER de reparación de uracilo, TbEndoV podría estar iniciando la reparación de los pares erróneos U:G inducidos por este agente genotóxico. Por último, se determinó la localización subcelular de TbEndoV en la forma procíclica del parásito. Los resultados indican que es una proteína de distribución predominantemente citosólica, sin embargo no se puede descartar su localización, aunque de forma minoritaria, en el núcleo celular. Además, bajo condiciones de estrés nutricional sufre una relocalización a gránulos de estrés, donde colocaliza con la helicasa DEAD-box de RNA Dhh1 (TbDhh1), un componente bien caracterizado de estas estructuras. En conclusión, TbEndoV muestra una mayor homología, tanto a nivel de secuencia primaria como a nivel funcional, con su ortólogo humano que con los miembros procarióticos de la familia EndoV. Los datos presentados en esta tesis doctoral muestran que TbEndoV actúa preferentemente sobre sustratos de RNA de cadena sencilla con inosina. Su especificidad de sustrato y su distribución subcelular indican un papel preferente en metabolismo de RNA, mientras que su capacidad para procesar DNA parece irrelevante. La enzima es esencial para la proliferación normal de formas procíclicas de T. brucei donde pudiera estar jugando un papel crítico en el metabolismo de RNAs que se expresan o se necesitan de forma específica en esta fase de vida del parásito.