Análisis de los genes glnA y su relación con el metabolismo del nitrógeno en Haloferax mediterranei

Zusammenfassung

Haloferax mediterranei es un microorganismo perteneciente al Dominio Archaea que fue aislado por primera vez en las Salinas de Santa Pola, Alicante. Esta arquea halófila es capaz de crecer con glucosa como única fuente de carbono y con nitrato como única fuente de nitrógeno. En el interior celular, el nitrato se convierte en amonio mediante la nitrato y nitrito reductasas asimilativas. En función de su disponibilidad intracelular el amonio puede asimilarse mediante dos vías: a altas concentraciones de amonio, este se asimila mediante la vía de la glutamato deshidrogenasa (GDH), mientras que a bajas concentraciones de amonio, este se asimila por el ciclo glutamina sintetasa (GS)-glutamato sintasa (GOGAT). La GS (EC 6.3.1.2) es una enzima clave tanto en la asimilación de amonio como en la biosíntesis de glutamina y de otros aminoácidos. Está presente en todos los Dominios de la vida, considerándose como un buen reloj molecular de la evolución ya que su secuencia muestra homología en todos los organismos. La familia de la GS está dividida en tres clases (GSI, GSII y GSIII) dependiendo de su secuencia, el gen que la codifique y del organismo al que corresponda. El genoma de Hfx. mediterranei contiene tres marcos de lectura abiertos que muestran homología con la GS y están codificados por los genes glnA-1, glnA-2 y glnA-3. Los genes glnA-2 y glnA-3 se encuentran localizados muy próximos en el genoma, únicamente separados por 1,6 kb, y a su vez dichos genes están separados del gen glnA-1. La proteína codificada por el gen glnA-1 tiene una identidad del 51,9% y del 49,1% con las proteínas codificadas por los genes glnA-2 y glnA-3, respectivamente. Las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 muestran una identidad entre sí de un 60,9%. La proteína GlnA-1 mantiene parcial o completamente conservadas las tres secuencias consenso características de las GS, mientras que las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 únicamente mantienen parcialmente conservada una de ellas (putative ATP_binding región signature PS00181). Además, en base a la presencia de los dominios conservados se determinó que las tres proteínas GlnA de Hfx mediterranei presentan el dominio catalítico PF00120 (Gln-synt_C) utilizado para la identificación de las GS tipo l. Analizando los aminoácidos presentes en cada una de las tres proteínas GlnA, se identificó que, de los 18 residuos aminoacídicos característicos de las GSI conservados universalmente, la secuencia de la proteína GlnA-1 presenta todos ellos, además del residuo de adenilación. Sin embargo, 8 de los residuos clave para la biosíntesis de glutamina se encuentran sustituidos por otros en las proteínas GlnA-2 y GlnA-3, careciendo además ambas proteínas del residuo de adenilación. El análisis del transcriptoma en función de la fuente de nitrógeno de la cepa mutante de deleción del gen glnA-1 (HM26-ΔglnA-1) reveló que los genes glnA-2 y glnA-3 no pueden sustituir la función del gen glnA-1. Además, estos últimos genes presentaron un perfil de expresión diferente al de glnA-1 en la cepa parental de Hfx. mediterranei HM26. En condiciones limitantes de nitrógeno, la deleción del gen glnA-1 afectó al nivel de expresión de genes involucrados en diferentes procesos metabólicos perteneciendo en su mayoría al metabolismo del nitrógeno, al metabolismo de las vesículas de gas y los relacionados con los sistemas CRISPR, sistemas de transporte y con reguladores transcripcionales. El estudio de expresión a nivel transcripcional en función de la fuente de nitrógeno de los genes glnA mediante RT-PCR reveló que los genes glnA-1 y glnA-2 se expresan en todas las condiciones analizadas (medio complejo, medio definido con amonio o nitrato 40 mM y en medio definido carente de nitrógeno) mientras que el gen glnA-3 no se expresa en estas condiciones. El estudio de expresión a nivel traduccional en función de la fuente de nitrógeno de las proteínas GlnA mediante Western blotting confirmó que la proteína GlnA1 se expresa en todas las condiciones analizadas (en medio complejo, y en los medios definidos con amonio, nitrato o glutamina 40 mM y en medio definido carente de fuente de nitrógeno) durante todas las etapas de crecimiento analizadas. Del mismo modo, este análisis de expresión reveló que la proteína GlnA-2 se expresa en todas las condiciones analizadas excepto al emplear medio complejo, pudiendo estar implicado algún mecanismo de regulación postranscripcional en la expresión de la proteína GlnA-2 en esta condición. Asimismo, la proteína GlnA-3 no mostró expresión en ninguna de estas condiciones analizadas ni en presencia de otras fuentes de nitrógeno (glutamato) o de carbono (citrato) ensayadas. La proteína recombinante GlnA-1, obtenida mediante expresión heteróloga, mostró una mayor actividad GS que las proteínas GlnA-2 y GlnA-3. Sin embargo, las proteínas recombinantes GlnA-2 y GlnA-3 mostraron valores elevados de actividad y-glutamil putrescina sintetasa mientras que GlnA-1 solo tiene cierta actividad residual cuando se emplea putrescina como sustrato. Los niveles de actividad y-glutamil putrescina sintetasa de las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 son unas 10 veces superiores a los valores de actividad GS. En los extractos de Hfx. mediterranei R4 crecidos en presencia de nitrato 40 mM como fuente de nitrógeno, en los cuales se expresan tanto la proteína GlnA-1 como GlnA-2, se observó una actividad GS mayor a la detectada en los extractos obtenidos a partir medio complejo. Por otra parte, Hfx. mediterranei R4 fue capaz de crecer con putrescina como única fuente de nitrógeno a diferentes concentraciones (20 - 250 mM), aunque las densidades ópticas alcanzadas fueron menores que las observadas al emplear otras fuentes de nitrógeno. En extractos proteicos obtenidos a partir de cultivos de Hfx. mediterranei empleando nitrato 40 mM o putrescina a diferentes concentraciones la actividad y-glutamil putrescina sintetasa fue mucho mayor a la detectada al emplear medio complejo como fuente de nitrógeno, condición donde la expresión de la proteína GlnA-2 no fue detectada. Para completar el análisis de las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 se generaron mutantes de deleción de los genes glnA-2 y glnA-3 a partir de la cepa parental de Hfx. mediterranei HM26 (ΔpyrE2) mediante la técnica pop-in/pop-out. Los mutantes obtenidos del gen glnA-2 resultaron ser mutantes homocigotos mientras que los mutantes del gen glnA-3 resultaron ser heterocigotos. La cepa mutante HM26-ΔglnA-2 se caracterizó fisiológicamente en diferentes medios de cultivos: medio complejo y medio definido con amonio, nitrato o glutamina como fuentes de nitrógeno. El análisis estadístico de los parámetros de crecimiento reveló que existían diferencias de crecimiento significativas entre la cepa parental HM26 y la cepa mutante HM26-ΔglnA-2 al emplear altas concentraciones de amonio y/o nitrato. El análisis de expresión a nivel traduccional de la cepa mutante HM26-ΔglnA-2 confirmó que la deleción del gen glnA-2 no afectó a la expresión de la proteína GlnA-1 ni a la ausencia de expresión de GlnA-3. Sin embargo, la deleción del gen glnA-2 afectó de forma significativa a la actividad y-glutamil putrescina sintetasa al emplear nitrato 40 mM como fuente de nitrógeno, confirmando la función del gen glnA-2 como una y-glutamil putrescina sintetasa más que una glutamina sintetasa.