Aplicación de la resonancia magnética nuclear a la caracterización estructural y dinámica de las proteínas de la capsida del virus vih1, metaloproteinasa3 y rusticinaina

Zusammenfassung

Hemos estudiado propiedades estructurales, dinámicas y de plegamiento de tres proteínas que participan en diversos procesos biológicos, a saber: mutante monomérico W40A del extremo C-terminal de la proteína de la cápsida del virus de la inmunodeficiencia humana-1 (CACW40A), metaloproteínasa-3 (MMP3) y proteína azul de cobre rusticianina (Rc). La correcta formación de la cápsida del virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) es un paso crucial para su infectividad. En este proceso es necesario que el extremo C-terminal de la principal proteína de la cápsida (CAC) dimerice, lo que, a su vez, requiere la participación del triptófano en posición 40. En la presente Tesis, hemos resuelto la estructura en disolución del mutante monomérico CACW40A. Este mutante posee una conformación tridimensional muy similar a cualquiera de las subunidades del dímero intacto de CAC. No obstante, la hélice- 2 (en la que se encuentra el aminoácido mutado) se desestabiliza extraordinariamente debido a la pérdida de interacciones cuaternarias esenciales. Hemos analizado cuáles son estas interacciones y discutido los motivos estructurales por los que no dimeriza este mutante de CAC. Por otra parte, MMP3 es una metaloproteasa de cinc capaz de degradar diversos componentes de la matriz extracelular. La sobreexpresión de esta proteína se encuentra asociada a la aparición de múltiples enfermedades. Por este motivo, MMP3 es una interesante diana terapéutica. En la presente Tesis, hemos resuelto la estructura en disolución del dominio catalítico de MMP3 con tres inhibidores orgánicos simples: NNGH, MLC88 e InhVII. Todos ellos poseen un grupo hidroxámico y los dos primeros, además, un grupo sulfonamida. Los tres se unen a MMP3 de forma similar. En primer lugar, su grupo quelante (hidroxamato) se une directamente al cinc catalítico. En segundo lugar, sus sustituyentes más voluminosos (un grupo fenilo en NNGH y un grupo bifenilo en MLC88 e InhVII) se disponen en la cavidad S1', mediante interacciones hidrofóbicas. Por último, se establecen diversos enlaces de hidrógeno proteína-inhibidor. Asimismo, hemos determinado la movilidad del complejo MMP3-NNGH. De estos estudios se deduce que, precisamente el bolsillo S1', es el dominio de la proteína con mayor movilidad. De la comparación del modo de unión de los tres inhibidores y de las propiedades dinámicas del enzima con sus afinidades por MMP3 hemos deducido interacciones claves proteína-inhibidor responsables de dicha afinidad. Nuestro último sistema de estudio ha sido la proteína azul de cobre rusticianina (Rc). Rc presenta muy alta estabilidad a valores de pH bajos. Además, su potencial redox es el mayor en esta familia de proteínas. Hemos estudiado el proceso de desplegamiento de Rc mediante cloruro de guanidinio empleando diversas técnicas espectroscópicas. Durante el proceso de desplegamiento de Rc aparecen agregados como consecuencia de la exposición al disolvente de regiones hidrofóbicas de la proteína. Hemos estudiado, asimismo, el papel del ion metálico y de su estado de oxidación en el proceso de desplegamiento. El metal estabiliza claramente la proteína. Hemos determinado también las propiedades dinámicas de la especie de Rc esencialmente plegada existente al inicio del proceso de desplegamiento. El lazo L9 de la proteína, que contiene al primer ligando del ion metálico, posee la mayor movilidad de esta especie. Por el contrario, las dos últimas hebras- de Rc, que contienen el resto de los ligandos del cobre, son las más rígidas y escondidas al disolvente. De estos estudios concluimos que el cobre se encuentra unido en la especie desplegada de la proteína a través de sus tres últimos ligandos. Hemos determinado también la cinética de unión del cobre a Rc. El cobre(II) se une lentamente (decenas de minutos) a rusticianina plegada, mientras que lo hace rápidamente (milisegundos) a la proteína desplegada. El cobre(I) se une a cualquiera de las formas de Rc rápidamente. Por último, también hemos obtenido los potenciales redox de Rc plegada y desplegada y la afinidad del cobre por ambas formas a dos valores de pH (2,5 y 7,0). El potencial redox de Rc disminuye con el pH, mucho más acusadamente que el de la proteína desplegada. El plegamiento de la proteína modula la diferente afinidad de ésta por los dos estados de oxidación del cobre.