Generación de neuronas con fenotipo colinérgico a partir de células embrionarias pluripotenciales de ratón

Zusammenfassung

Durante los últimos años la investigación básica en enfermedades neurodegenerativas sigue dos aproximaciones para dilucidar su origen y para su tratamiento: 1) la producción de animales transgénicos que permitirá desvelar las alteraciones que conducen a la enfermedad y 2) la aplicación de la terapia celular. Esta consiste en el trasplante de células sanas, generalmente de procedencia embrionaria, al cerebro adulto donde las neuronas sobreviven, maduran y mejoran la sintomatología. La principal limitación de estos tratamientos es la obtención de tejidos embrionarios en cantidades suficientes para los trasplantes, y es por ello que la generación in vitro de células neuronales es uno de los retos actuales para el desarrollo de la terapia celular y genética de los trastornos del SNC. Las células embrionarias pluripotenciales (celulas ES) son una línea celular derivada de la masa celular interna del blastocisto con un potencial proliferativo ilimitado, que pueden ser propagadas clonalmente y que retienen su fenotipo de célula no tumoral con cariotipo euploide. Además, al igual que el epiblasto, las células ES son capaces de diferenciarse a todos los tipos celulares de las tres hojas embrionarias incluyendo la línea germinal. El objetivo global del presente trabajo ha sido la obtención de neuronas diferenciadas con fenotipo colinérgico a partir de células embrionarias pluripotenciales para su uso en una futura terapia celular en la enfermedad de Alzheimer, ya que en esta enfermedad se produce una degeneración de las neuronas colinérgicas en varias zonas del cerebro que conlleva un deficit del neurotransmisor acetilcolina (ACh) dando lugar a las alteraciones cognitivas características. Para conseguir este objetivo se han llevado a cabo los siguientes pasos: 1. Construcción de un plásmido que dirige la expresión de ChAT en células ES tras su diferenciación a neuronas. Para ello se ha insertado el gen ChAT detras de un promotor específico neuronal. 2. Obtención de células ES indiferenciadas con integración estable del plásmido, mediante electroporación y posterior selección. Las células ES se han transfectado conjuntamente con el plásmido construído en el objetivo 1 y con un segundo plásmido que permite su selección. 3. Diferenciación a neuronas de las células ES transfectadas Mediante diferentes métodos las ES indiferenciadas son dirigidas hacia fenotipos neuronales, las cuales expresan ChAT (al estar bajo un promotor específico neuronal). 4. Caracterización inmunocitoquímica de las neuronas obtenidas, demostrando su fenotipo completamente neuronal y la expresión de la proteína ChAT, enzima encargada de sintetizar el neurotransmisor acetilcolina.