Biomarcadores celulares y humorales y neumonía precoz asociada a ventilación mecánica invasiva, en el insulto agudo cerebral hemorrágico no traumático

Resumen

INTRODUCCIÓN: La neumonía asociada a ventilación mecánica (NAVM) invasiva, es una infección nosocomial de elevada prevalencia en las unidades de pacientes críticos, constituyendo una de las más frecuentes complicaciones infecciosas tras un proceso vascular cerebral agudo. El desarrollo de NAVM está asociada a mayor morbimortalidad y estancia hospitalaria con el consiguiente aumento de los costes. Planteamos el estudio de diferentes biomarcadores asequibles desde el punto de vista técnico y económico para establecer los que pudieran tener capacidad de predicción de la aparición de NAVM en su fase preclínica. Tras revisión bibliográfica comprobamos que uno de los múltiples cambios manifestados por los neutrófilos durante la respuesta inmune o durante la respuesta inflamatoria aguda, es la expresión del antígeno CD64 (receptor Fc¿RI), regulada por diferentes citoquinas. Su determinación se realiza mediante citometría de flujo con utilización de anticuerpos monoclonales. La expresión de los complejos de diferenciación leucocitaria CD4+ y CD8+ en la superficie de los linfocitos que se determina también mediante técnicas de citometría de flujo ha sido estudiada en contexto de infección grave. Este es el primer estudio que, mediante el análisis de diferentes biomarcadores seleccionados por su disponibilidad y coste económico, valora la predicción de aparición clínica de neumonía en fase precoz asociada a ventilación mecánica invasiva en adultos. HIPÓTESIS: La monitorización plasmática de los niveles de proteína C reactiva, procalcitonina, y de la expresión de los complejos de diferenciación leucocitaria CD64, CD4+ y CD8+, puede tener valor discriminativo para predecir la aparición de neumonía en fase precoz asociada a ventilación mecánica invasiva. La posibilidad de establecer qué pacientes van a desarrollar neumonía asociada a ventilación mecánica de aparición precoz, nos permitiría optimizar la estrategia de tratamiento, iniciar una antibioterapia empírica en relación a nuestro medio y reducir la morbi-mortalidad asociada al proceso infeccioso. OBJETIVOS: El objetivo principal fue relacionar la fórmula y recuento leucocitarios, los niveles plasmáticos de proteína C reactiva, procalcitonina y la expresión celular de los antígenos de diferenciación leucocitaria CD64 en neutrófilos y los linfocitarios CD4+ y CD8+ en las primeras 48 horas de ventilación mecánica invasiva, con el desarrollo de neumonía precoz. Como objetivos secundarios planteamos el establecer la evolución en las primeras 48 horas de ventilación mecánica invasiva e identificar el valor de corte discriminativo para neumonía precoz asociada a ventilación mecánica, de estos Biomarcadores. PACIENTES Y MÉTODO: Estudio prospectivo, observacional y de cohortes en pacientes con insulto cerebral agudo grave de origen vascular hemorrágico, en ventilación mecánica invasiva durante más de 96 horas, ingresados en una unidad de Cuidados Intensivos polivalente de 24 camas de un hospital universitario, en un periodo de estudio de 14 meses. Los criterios de exclusión se definieron por: edad ¿ 18 años o ¿ 75 años, enfermedad pulmonar aguda o crónica conocida, patología infecciosa en fase activa, tratamiento con bloqueantes selectivos Beta-1, inmunosupresión o proceso autoinmune, insuficiencia renal en hemodiálisis o diálisis peritoneal, shock o inestabilidad hemodinámica, cirugía mayor en los últimos 3 meses, embarazo, procedentes de instituciones de carácter colectivo. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital General Universitario de Alicante, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes por sus familiares más cercanos. Para el cálculo del tamaño muestral se realizó un estudio piloto con los primeros 8 casos del estudio, con la utilización del programa informático EPIDAT, realizándose la diferencia de medias calculadas en los tiempos T1 y T2, para el valor absoluto de la expresión del complejo de diferenciación leucocitaria CD64 de los neutrófilos, en el grupo de neumonía asociada a ventilación mecánica de aparición precoz (NAVM) con valor de razón entre muestras de 1,5, un nivel de confianza del 95% y una potencia del 80% (error ß 20%). Se obtuvo que sería necesaria una n de 45 (27 casos con NAVM y 18 casos de NO NAVM) para obtener una p<0,05. La variable de resultado fue la puntuación de la escala CPIS. Consideramos neumonía precoz asociada a ventilación mecánica su aparición en los primeros 4 días y transcurridas las primeras 48 horas, contabilizadas a partir del inicio de la ventilación mecánica. Su diagnóstico se estableció por la existencia de una puntuación CPIS superior a 6 puntos a las 48, 72 ó 96 horas de la intubación orotraqueal y conexión a ventilación mecánica. El diagnóstico final de neumonía se realizó por separado por 2 facultativos, en base a la puntuación otorgada a cada uno de los criterios establecidos en la escala CPIS. Las variable explicativas primarias fueron: número absoluto de CD4+, CD8+, cociente CD4/CD8, CD64, intensidad de fluorescencia media, MIF, de los CD64 y cociente MIF CD64 de los neutrófilos / MIF CD64 de los linfocitos, procalcitonina (ng/ml), proteína C reactiva de alta sensibilidad (mg/ml), número absoluto de leucocitos (nº x 10 mm3) y porcentaje de neutrófilos, linfocitos, eosinófilos y monocitos. Las variable explicativas secundarias fueron: Glasgow Coma Store (GCS) inicial y al ingreso en la Unidad., valoración Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II (APACHE II) máximo en las primeras 24 horas de ingreso, puntuación del Secuential Organ Failure Assessment (SOFA store) a las 24 y 48 horas desde el ingreso en UCI, patrón microbiológico, determinación de temperatura corporal central (0C) mediante medición intravesical, valoración infiltrados pulmonares en radiografía de tórax. Se establecieron cinco tiempos evolutivos en ventilación mecánica, en relación al momento de aislamiento de la vía aérea: TIEMPO 0: tiempo ¿ 60 minutos, contabilizado a partir de la intubación orotraqueal y conexión a ventilación mecánica. TIEMPO 1: a las 24 horas de la intubación. TIEMPO 2: a las 48 horas de la intubación. TIEMPO 3: a las 72 horas de la intubación. TIEMPO 4: a las 96 horas de la intubación. La determinación de diferentes biomarcadores, se realizó, para PCT test inmunológico cuantitativo en suero humano, Inmunoensayo ECLIA de electroquimioluminescencia en inmunoanalizador Cobas E 601. En nuestro laboratorio, valores plasmáticos > 0,5 ng/ml se consideran anormales, con coste por determinación en nuestro laboratorio de 12,34 €. La PCR se determinó por test inmunoturbidimétrico potenciado por partículas con equipo de medición Cobas C 501 con coste por determinación de 1,82 €. La expresión de CD64 (Fc¿RI) se determinó mediante toma de muestras de sangre obtenidas en horario matutino, de la vena basílica sin trauma, ni estasis, anticoaguladas con EDTA y procesadas en un tiempo inferior a 24 horas en el citómetro de flujo (Cytomics FC500 Beckmann-Coulter Fluoresferas Flow Check pro Beckmann-Coulter) con anticuerpos monoclonales usando un kit de cuantificación de fluorescencia de phycoerythrim (FITC. Becton-Dickinson). La interpretación tras el marcaje y lisado se realizó por lectura en citómetro FC500 (programa CXP), y la selección de neutrófilos se realizó con estrategia de gateo secuencial SSC/CD45/CD33/CD16 y la de linfocitos T, control negativo de CD64 de los neutrófilos, por estrategia de gateo secuencial SSC/CD45/CD33/ CD3. Seleccionada la población a través de histograma, determinamos la media de intensidad de fluorescencia, MIF, de CD64 en neutrófilos, obteniendo un valor numérico considerado indicador de la expresión del antígeno CD64 en la superficie del neutrófilo. Previamente y para obtener un valor de referencia en las muestras a estudio, se realizaron determinaciones en controles sanos, voluntarios, y en los primeros 5 casos del estudio. Posteriormente, establecimos el índice MIF de CD64 de Neutrófilos / MIF de CD64 linfocitos T, al considerar la expresión de CD64 en linfocitos como control negativo endógeno. Dados los diferentes procedimientos de laboratorio para determinar el índice de fluorescencia media de los CD64, los valores del punto de corte óptimo fueron determinados por un programa estadístico a través de software del ordenador y no de forma manual, garantizando por este procedimiento su comparación con resultados de otros estudios. Los resultados se obtuvieron entre 4 y 6 horas tras procesamiento en el laboratorio. El coste por determinación en nuestro laboratorio es de 40 €. Los valores relativos (%) y absolutos (/mm3) de CD4+ se determinaron mediante citómetro de flujo (FACScanto cytometer Becton Dickinson); supuso un coste por determinación en el laboratorio de Inmunología de 16 €. Los valores relativos (%) y absolutos (/mm3) de CD8+ se determinaron mediante el mismo sistema y con similar coste por determinación que CD4+. Para el estudio microbiológico se tomaron muestras respiratorias mediante aspirado endotraqueal cuantitativo al ingreso en la Unidad y en los tiempos T1, T2, T3 y T4 y ante sospecha de neumonía. Consideramos que la muestra respiratoria es de calidad cuando se observan > 25 leucocitos polimorfonucleares y <10 células epiteliales por campo microscópico (x100 aumentos). Tras tinción de Gram, se realiza valoración de cultivos en medios selectivos y no selectivos a las 24 y 48 horas de incubación en campana de CO2, con interpretación de gérmenes aislados de significación clínica, diferenciación de la flora orofaríngea normal y cuantificación del número de unidades formadoras de colonias por mililitro de muestra analizada (para que sea representativa en caso de aspirado traqueal cuantitativo, se deben obtener >106 unidades formadoras de colonias/ml). Aisladas las colonias representativas de gérmenes patógenos en la muestra respiratoria se procede a identificación bioquímica de la especie bacteriana por estudio bioquímico (sistema automatizado BITECK®), realización de antibiograma con determinación de concentración mínima inhibitoria para definir sensibilidad o resistencia a los antibióticos testados según paneles de Gram positivo o negativo. RESULTADOS a) Estudio descriptivo: Se registraron las características demográficas y de comorbilidad de los 25 pacientes del estudio en dos grupos: grupo NAVM invasiva de aparición precoz 15 pacientes (60%) y grupo NO NAVM 10 pacientes (40%). Del total de pacientes que desarrollaron NAVM, 8 (57,14%) fueron mujeres. La edad, el sexo, raza, el índice de masa corporal en kg/m2 y la comorbilidad no presentaron diferencias significativas entre ambos grupos. No hubo diferencias entre ambos grupos en los parámetros de ventilación mecánica en las primeras 48 horas, sin seguir un protocolo definido inicialmente para el estudio. La puntuación APACHE II de las primeras 24 horas del ingreso fue superior en el grupo de NAVM precoz, con diferencia estadística significativa entre ambos grupos (22,86±3,80 vs 18,33±5,77; respectivamente; p=0.033). La valoración de la escala SOFA en los tiempos T1 y T2, no presentó diferencias significativas. De los 15 pacientes que desarrollan NAVM, 9 fueron intubados y conectados a respirador de transporte a nivel prehospitalario, de los cuales 8 (88,89%) desarrollaron NAVM precoz (53,33% del total de NAVM precoz). De los 15 pacientes del grupo NAVM, 13 pacientes (86,66%) tuvieron una puntuación superior a 6 puntos en el tiempo T3. La media de puntuación de CIPS máxima en el tiempo T4 en el grupo NO NAVM fue de 2,22 puntos vs del grupo de NAVM 9,43 puntos. La temperatura corporal central medida a nivel intravesical en los tiempos T0, T1 y T2, no mostró diferencias entre ambos grupos. b) Biomarcadores. En el tiempo T0 y T1, no hubo diferencias estadísticas significativas en los biomarcadores estudiados entre ambos grupos. Los niveles plasmáticos de procalcitonina (PCT) y de proteína C reactiva (PCR), en los tiempos T0, T1 y T2 no presentaron diferencias estadísticas significativas entre ambos grupos. La curva ROC del valor de PCR en el tiempo T2 presenta para el punto de corte (10,9850 mg/dl) en el grupo de NAVM, un área bajo la curva (AUC) 0,683; 95% CI 0,425-0,941 con significación estadística (p=0,02) para predicción de NAVM. La curva ROC de PCT en el tiempo T2 en el grupo de NAVM para el punto de corte (0,950 ng/ml), presenta un área bajo la curva 0,321; 95% CI 0,124-0,544, sin significación estadística para predicción de NAVM (p=0,311). El índice de intensidad de fluorescencia media (MIF) de la expresión CD64 de los neutrófilos / MIF CD64 linfocitos presentó diferencias estadísticas significativas entre ambos grupos (0,69±0,07 grupo NAVM vs 0,60±0,13 grupo NO NAVM; p=0,048). No podemos definir un punto de corte óptimo con significación estadística para la predicción de neumonía precoz asociada a ventilación mecánica invasiva, dadas las diferencias entre los valores de sensibilidad >90% frente a valores de especificidad <30%, efecto atribuible a la dispersión de los valores obtenidos en un tamaño muestral reducido. Las curvas ROC en el tiempo T2 para la predicción de neumonía precoz asociada a ventilación mecánica, en el grupo de NAVM fue para los linfocitos CD4+ un área bajo la curva 0,740; 95%IC 0,520-0,960; p=0.07 y para los linfocitos CD8+ un área bajo la curva 0,778; 95% CI 0,586-0,991; p=0,025 versus grupo de NO NAVM. El número absoluto de linfocitos CD8+ presentó la mayor área bajo la curva con diferencias estadísticas significativas frente al grupo de NO NAVM. La curva ROC de la media de intensidad de fluorescencia MIF CD64 en el tiempo T2 para la predicción de neumonía precoz asociada a ventilación mecánica en el grupo de NAVM, presenta un área bajo la curva 0,667; 95% CI 0,368-0,996, con significación estadística (p=0,030). El cociente del índice MIF CD64 de los neutrófilos / MIF CD64 linfocitaria en el tiempo T2 para la predicción de neumonía precoz asociada a ventilación mecánica en el grupo de NAVM, presenta un área bajo la curva de 0,690 con 95% CI 0,465-0,916, con significación estadística (p=0,048) versus grupo de NO NAVM. En base a los resultados en el tiempo T2, con punto de corte óptimo determinado por su mejor valor de sensibilidad y especificidad definido por el índice de Youden, se estableció para PCR un valor de 10,9850 mg/dl, para procalcitonina 0,950 ng/dl, y de los antígenos de diferenciación leucocitaria para los linfocitos CD4+ y CD8+ valores de 264 /µl y 177/µl respectivamente, y para la media de intensidad de fluorescencia, MIF, en neutrófilos un valor absoluto de 0,945. Se realizó estudio multivariante de asociación entre dichos valores de forma conjunta y el desarrollo de NAVM invasiva de aparición precoz y para cada una de las asociaciones de biomarcadores calculando la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y cociente de probabilidad positiva con intervalos de confianza al 95%, con los siguientes resultados: La asociación CD4+, CD8+ y PCR, demuestra significación estadística para la predicción de NAVM precoz (p = 0,002). La asociación CD4+, CD8+ y CD64, demuestra significación estadística para la predicción de NAVM precoz (p < 0,001). La asociación CD8+, CD64 y PCR, demuestra significación estadística para la predicción de NAVM precoz (p < 0,001). La asociación CD4+, CD64 y PCR, demuestra significación estadística para la predicción de NAVM precoz (p = 0,002). La asociación CD4+, CD8+, PCR y CD64, demuestra significación estadística para la predicción de NAVM precoz (p ¿ 0,001). La asociación de CD4+, CD8+, CD64, PCR y procalcitonina, no demuestra significación estadística para la predicción de NAVM precoz (p= 0,068). c) Aislamiento microbiológico. De los 15 pacientes que desarrollaron NAVM precoz, ninguno con hemocultivo positivo, ni con antibioterapia previa, 10 pacientes (66,67%) presentaron aislamientos positivos y 5 (33,33%) negativos. Para considerar válido el aislamiento de colonias en las muestras de aspirado traqueal se consideró de forma estricta un recuento >106 unidades formadoras de colonias/ml, información obtenida como punto de corte, e imposibilitando efecto d ela carga bacteriana sobre el desarrollo precoz de neumonía. De los aislamientos positivos del aspirado traqueal selectivo, en 4 (40%) fueron cocos Gram positivos como flora única, en 3 (30%) bacilos Gram negativos y 3 (30%) polimicrobianos, con la siguiente distribución: Cocos Gram positivos como germen único: Streptococcus pneumoniae en 2 aislamientos, y Staphhylococcus aureus meticilin sensible 2 aislamientos. Bacilos Gram negativos como gérmen único: 1 aislamiento Haemophilus parainfluenzae y 2 aislamientos con Haemophilus influenzae. Polimicrobiano: Streptococcus pneumoniae + Staphhylococcus aureus meticilin sensible; Escherichia coli + Staphhylococcus aureus meticilin sensible; Streptococcus pneumoniae + Haemophilus influenzae DISCUSIÓN: a) Variables descriptivas. En la población estudiada con edad media < 65 años en ambos grupos, se evidenció un alto porcentaje de NAVM precoz, incidencia que relacionamos en nuestro estudio con las condiciones en las que se realiza el aislamiento y conexión a la ventilación mecánica en el medio prehospitalario en situaciones de emergencia. Un estudio multicéntrico realizado por la Sociedad Española de Medicina Intensiva, SEMICYUC en más de 16.000 pacientes evidenció un riesgo 23,6 veces mayor en pacientes intubados respecto de aquellos pacientes que no requieren invasión de la vía aérea, sin valorar el lugar, hospitalario o prehospitalario, que se realiza el aislamiento de la vía aérea. Por ello, en ocasiones el término de neumonía relacionada con la intubación orotraqueal pudiese ser más adecuado que el de neumonía asociada a ventilación mecánica. Ello conllevaría incluir el lugar de realización de la intubación como un factor de riesgo en el listado de los múltiples factores de riesgo implicados en la fisiopatología de la neumonía. De las escalas de gravedad utilizadas, el grupo que desarrolló NAVM invasiva de aparición precoz tuvo una mayor puntuación APACHE II máxima en las primeras 24 horas con significación estadística (p=0,033), una menor puntuación al ingreso en la Unidad del GCS si bien con mayor número de pacientes con aislamiento de la vía aérea y una puntuación SOFA score a las 48 horas del ingreso en la Unidad ligeramente superior sin alcanzar ambas puntuaciones significación estadística. Hallazgos que relacionan la puntuación en las escalas de gravedad con la tendencia al desarrollo de NAVM precoz. El estudio comparativo de la puntuación máxima en la escala de gravedad APACHE II de las primeras 24 horas con diferentes puntos de corte > 20, 16-20 y ¿ 15 puntos, asociado con mortalidad de cualquier causa y de aparición en los primeros 30 días de evolución fue ¿ 56,94, 36,71% y ¿ 14,93 respectivamente. b) Biomarcadores. Los biomarcadores humorales, procalcitonina y proteína C reactiva no mostraron diferencias significativas entre ambos grupos en el tiempo T2. Los valores iniciales de PCR y su cinética de evolución se relacionan con el comportamiento como proteína reactante de fase aguda en ambos grupos, como respuesta al proceso intraparenquimatoso cerebral agudo. El nivel plasmático de la PCT, no demostró validez como predictor de aparición de neumonía precoz.. Nuestros resultados apoyan las conclusiones recientes del grupo de Jung donde la determinación de PCT alveolar obtenida mediante LBA no es un marcador válido para la detección de NAVM invasiva, al igual que confirmaron que la determinación de PCT sérica no es un biomarcador predictivo de NAVM. De los biomarcadores celulares el número absoluto de leucocitos, neutrófilos, linfocitos, monocitos y eosinófilos, no presentaron diferencias. No hubo, diferencias en la cifra de neutrófilos en valor absoluto como sería esperable al inicio de un posible proceso infeccioso agudo. La media de intensidad de fluorescencia, MIF, de CD64 en neutrófilos >1, presenta una correlación estadísticamente significativa para el desarrollo de NAVM (p = 0,030). El valor de MIF CD64 en neutrófilos de 0,945 determina una sensibilidad >90%, una especificidad baja con un valor predictivo negativo cercano al 90% para desarrollo de NAVM precoz. La elección del punto de corte óptimo de 0,945 para MIF CD64 en neutrófilos con la sensibilidad y especificidad referidas se realizó al preferir disponer de una prueba sensible, pese a la pérdida de especificidad, <90%, si bien con aceptables valores predictivos. Ello supone en esta situación en la que toda neumonía debe de ser precozmente diagnosticada y tratada, que el inicio del tratamiento antibiótico empírico aún a costa de la baja especifidad supondría un importante beneficio por su precocidad. Máxime tras los resultados del estudio EDUSEPSIS que muestran en sepsis grave que únicamente la administración precoz, en la primera hora, de un antibiótico de amplio espectro se asocia a una menor mortalidad. El recuento en valor absoluto de linfocitos CD4+/ µl en el tiempo T2 fue mayor en el grupo NAVM, acercándose a la significación estadística (p= 0,07), un punto de corte con valor de 264 CD4+/µl determina una sensibilidad >90% con baja especificidad para el desarrollo de NAVM. Hallazgo opuesto al del grupo de Pelekanou con resultado de descenso en las cifras de CD4+ en sepsis originada por desarrollo de NAVM103; si bien, concordante con el hallazgo en sepsis con origen de infección en otras localizaciones. El valor absoluto de linfocitos CD8+/ µl en el tiempo T2 fue mayor en el grupo NAVM, alcanzando significación estadística (p= 0,025). Un punto de corte con valor de 177 CD8+/µl determina una sensibilidad del 100% con baja especificidad para el desarrollo de NAVM precoz. Nuestros resultados contradicen los descrito en el estudio de Bohé y colaboradores82 donde se no observa un incremento de el valor absoluto de CD8+ como efecto de células regulatorias de estirpe T en pacientes con diagnóstico de shock séptico. A partir de la descripción de la determinación del valor absoluto de CD8+/µl como un biomarcador de utilidad en el diagnóstico de NAVM, sería de interés un estudio más amplio con evaluación de subpoblaciones de este antígeno de diferenciación leucocitaria (CD8 exausted, CD8¿¿, CD8 TNF-¿ y CD8 citotóxico) mediante la utilización de anticuerpos monoclonales específicos y medición mediante citometría de flujo. El estudio multivariante de asociación simultánea de los tres antígenos de diferenciación leucocitaria CD4+, CD8+ en linfocitos y MIF CD64 en neutrófilos, con los puntos de corte óptimos definidos en el tiempo T2 con mejor índice de Youden, para la predicción de la NAVM invasiva de aparición precoz presenta una sensibilidad y valor predictivo negativo >80% con especificidad y valor predictivo positivo del 100%, con significación estadística (p= <0,001) entre ambos grupos, determinando un riesgo 5 veces superior de desarrollo de NAVM precoz (razón de prevalencia 5,0; IC 95% 1,5-17,3). Nuestros resultados ponen de manifiesto que las determinaciones de los complejos de diferenciación leucocitaria se modifican, aumentan sus niveles, en relación al pasaje del silencio clínico a la eclosión clínica. Es decir, su expresión se manifiesta antes del comienzo de las manifestaciones clínicas, de ahí el interés del estudio y la necesidad de validar los resultados. La determinación del pico y el tiempo de mantenimiento de niveles elevados una vez iniciado el proceso clínico, no ha sido objeto del presente estudio. Si bien, dada la complejidad del proceso, el resultado tanto diagnóstico, como pronóstico o evolutivo no puede estar representado por un solo biomarcador ya sea celular o humoral. De ahí que hoy por hoy, la solución es la combinación de varios biomarcadores como queda expresado por los valores de sensibilidad [85,71; 95% IC (82,03-89,40)], especificidad [100; 95% IC (94,44-100,00)], valor predictivo positivo [100; 95% IC (95,83-100,00)] y valor predictivo negativo [81,82; 95% IC (77,13-85,50)] para la predicción de NAVM de inicio precoz cuando se combinan los tres antígenos de diferenciación leucocitaria definidos por el mejor punto de corte (que define el índice de Youden) en la búsqueda de establecer la precocidad diagnóstica o la predicción de aparición. Nuestros resultados así lo apoyan con la necesidad de continuar la investigación pero en etapas precoces que aunque silentes bajo el punto de vista clínico, su fisiopatología nos indica la iniciación del proceso. c) Limitaciones del estudio. El cálculo inicial del tamaño muestral fue de 45 pacientes, tamaño no alcanzado dada la dificultad de selección de pacientes en base a los criterios de inclusión y exclusión establecidos, al ser pacientes con proceso hemorrágico agudo cerebral no traumático, que requirieron ventilación mecánica invasiva y con ausencia de foco infeccioso de cualquier localización. De ahí, que los resultados sea difícilmente extrapolables a otro tipo de pacientes con NAVM al tratarse de un grupo muy seleccionado y homogéneo. La ausencia de disponibilidad diaria para la determinación de los complejos de diferenciación leucocitaria en nuestro hospital y el corto margen de tiempo para su estudio una vez obtenida la muestra, máximo 24 horas, han sido con los criterios de inclusión, los principales limitantes del reclutamiento. A ello se suma la implantación en la Unidad del proyecto ¿Neumonía Zero¿. Proyecto, que interfiere de manera significativa con los criterios de inclusión establecidos en nuestro estudio dado la utilización sistemática de medidas de decontaminación oral selectiva y de profilaxis mediante antibioterapia intravenosa de amplio espectro. Por ello es necesario la confirmación de nuestros resultados en estudios de series más amplias para establecer su validez dada las limitaciones metodológicas y el tamaño muestral. Sin embargo, dado el posible interés de los hallazgos los presentamos como estudio preliminar. d) Visión futura del estudio. El estudio realizado puede considerarse con un paso más en la descripción de los fenómenos de inmunidad celular y humoral que se desencadenan ante un proceso infeccioso. Los resultados obtenidos, muestran el interés de incluir la determinación habitual de los diferentes subtipos de CD8+ mediante técnica de citometría de flujo. Sería conveniente en un futuro próximo aumentar el tamaño muestral, ya sea en la propia Unidad, realizando un estudio multicéntrico, dada la dificultad de inclusión de casos por los estrictos criterios de exclusión. La limitación actual que supone la utilización sistemática de profilaxis antibiótica y técnicas de decontaminación digestiva por la implantación en la mayoría de las unidades de críticos españolas del proyecto ¿Neumonía Zero¿ impide en este momento la continuidad del estudio. CONCLUSIONES: 1.- La determinación seriada en las primeras 48 horas de ventilación mecánica invasiva de la expresión cuantitativa de la asociación de los complejos de diferenciación leucocitaria CD4+, CD8+ y CD64, puede ser predictora en adultos con hemorragia intraparenquimatosa cerebral aguda no traumática, de neumonía bacteriana asociada a ventilación mecánica de aparición precoz, con una especificidad y valor predictivo positivo del 100%. 2.- En adultos con hemorragia intraparenquimatosa cerebral aguda no traumática, la determinación conjunta de la expresión cuantitativa de los complejos de diferenciación leucocitaria CD4+, CD8+ y CD64, y proteína C reactiva de alta sensibilidad, es predictora de neumonía bacteriana asociada a ventilación mecánica invasiva de aparición precoz, con especificidad y valor predictivo positivo del 100%, sin mejorar los valores de sensibilidad y valor predictivo negativo con respecto a la determinación aislada de los antígenos de diferenciación leucocitaria. 3.- En la población estudiada, la asociación de procalcitonina, complejos de diferenciación leucocitaria CD4+, CD8+ y CD64, y de proteína C reactiva de alta sensibilidad, presenta una especificidad y valor predictivo positivo del 100%, con baja sensibilidad y valor predictivo negativo. 4.- El valor de corte discriminativo a las 48 horas del inicio de la ventilación mecánica invasiva de los complejos de diferenciación leucocitaria CD4+, CD8+ y CD64, y de la PCR de alta sensibilidad establecido como predictor de neumonía bacteriana asociada a ventilación mecánica invasiva de aparición precoz, presenta sensibilidad y valor predictivo negativo del 100%. El resto de los biomarcadores estudiados presentan de forma aislada, bajos valores de sensibilidad y valor predictivo positivo, principalmente la procalcitonina. 5.- La combinación como biomarcadores, del número absoluto de linfocitos/µl CD4+ y CD8+ y de la expresión de la media de intensidad de fluorescencia, MIF, CD64 en neutrófilos, determinada por los puntos de corte con mayor índice de Youden, presenta especificidad y valor predictivo positivo del 100% para la predicción de neumonía bacteriana asociada a ventilación mecánica invasiva de aparición precoz.