Movilidad de factores de virulencia del patógeno E. Coli O157H7 y otros serotipos

Resumen

Los elementos genéticos móviles (EGMs) tienen la capacidad de transportar el ADN bacteriano y hacer que prácticamente cualquier gen presente en una bacteria pueda ser movilizado a otra. Los bacteriófagos son un tipo de EGM que permiten la movilización de genes de una cepa bacteriana a otra, pudiendo generar nuevas cepas patógenas si el gen que transfieren codifica para una proteína que provoca virulencia. En esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de los bacteriófagos portadores de genes de virulencia como EGMs. Para ello se estudió, en primera instancia, la presencia de bacteriófagos Stx2 en heces de individuos sanos, dado que se ha demostrado su presencia y capacidad de infección en alimentos aptos para el consumo humano y en aguas residuales. La presencia de fagos Stx en heces humanas aparece como la conexión entre su prevalencia en los alimentos, los cuales al ser ingeridos incorporan los fagos Stx, y su detección en agua residual, como resultado de su excreción. Se detectó la presencia de fagos Stx en las heces de individuos sanos y se evaluó su capacidad infectiva. La evolución de las cepas Shiga toxin Escherichia coli (STEC) se determinó a partir de ancestros stx-negativos y que inicialmente no poseían el resto de genes necesarios para producir la enfermedad. Por ello se estudiaron los genes de virulencia en cepas STEC ambientales, permitiendo observar los diferentes estadios intermedios en las evoluciones de las cepas STEC. Las variantes de stx encontradas fueron stx2a y stx2c, que corresponden a las variantes asociadas a mayor virulencia. El estudio de la distribución de los genes de virulencia según su origen reveló claramente que las cepas que contenían un mayor número de factores de virulencia eran cepas de origen vacuno, seguidas de las de origen humano, siendo el serotipo O157:H7 el que contenía mayor número de genes de virulencia. En general, los genes de virulencia que se detectaron con mayor frecuencia fueron aquellos que no estaban codificados en el denominado locus for enterocyte effacement (LEE). El gen más predominante fue hlyA que codifica para una enterohemolisina seguido por el gen nleC y el gen saa El desarrollo de una matriz para visualizar la distribución de los genes entre sí permitió la detección de dos agrupaciones: el grupo formado por genes codificados en LEE y otros genes como espJ, espM, nleB2, nleC, nleD, nleE, nleF, nleA, nleH1 y tccP; y los genes saa, hlya, stx1, cdt y cif que raramente se encontraban en combinación con otros genes, y probablemente se movilicen independientemente mediante algún tipo de EGM. A continuación, nos centramos en el estudio de los genes no descritos en fagos que parecía que se movilizaban de forma independiente y, más en concreto, en el gen saa. El gen saa codifica para una adhesina que se encuentra en las cepas STEC que no codifican para LEE. Se analizaron las diferentes variantes del gen en las cepas STEC saa+ aisladas y se observó y cuantificó la adherencia a células Hep2. En contacto con un agente inductor como la Mitomicina C, el número de copias del gen saa aumentaba hasta 4 unidades logarítmicas y se observó hibridación positiva con una sonda saa en calvas de lisis. Estos resultados sugieren que saa puede ser un gen movilizado por un bacteriófago o, al menos, movilizado mediante una cápside proteica. La banda de CsCl en la que se detectaba el gen saa se observó por microscopia electrónica revelando una morfología tipo Podoviridae. Se confirmó por proteómica la presencia de proteínas fágicas en la fracción de CsCl donde se detectaba saa, siendo una de ellas homóloga a proteínas tipo gene transfer agents (GTA). A sí mismo, se detectó la presencia de saa en la fracción viral de diferentes muestras de origen animal y humano. Finalmente, dado que el primer paso para que una cepa llegue a ser infectada por un fago es la unión de éste a los receptores de membrana de la bacteria provocando la activación de las respuestas de estrés de membrana, se estudiaron la influencia de los sistemas de estrés de membrana en la conversión lisogénica de la bacteria. Los resultados obtenidos indican que la vía BaeSR está implicada en la formación de lisógenos. A pesar de que los fagos Stx son un grupo muy heterogéneo, este resultado se observó con distintos fagos Stx y se determinó que este efecto se debía a los receptores de membrana BamA.