Hydrogen bioproduction by dark fermentation

Resumen

El hidrógeno (H2) es en la actualidad una de las fuentes de energías renovables más prometedora. Posee el máximo rendimiento energético por unidad de peso, siendo fácil almacenar y de transportar. Además, el H2 es limpio, produce sólo agua cuando se quema, eliminando los problemas de contaminación atmosférica y efecto invernadero que tienen los combustibles fósiles (Mizuno 2000; Khanal et al, 2004; Liu y Shen, 2004; Thong et al, 2008; Jo et al, 2008; Pan et al, 2008; Wang y Wan, 2008; Oztekin et al, 2008). El H2 se genera en la actualidad mediante diferentes procesos: reformado de gas natural, gasificación de carbón y pirólisis, que utilizan combustibles fósiles no renovables y requieren un aporte de energía, o procesos electroquímicos, que tienen un elevado consumo energético. Su producción biológica soslaya ambos inconvenientes. Existen, en efecto, dos mecanismos posibles para producir "biohidrógeno", a saber la foto reducción y la fermentación oscura o ácida. La fermentación oscura implica la conversión de substratos orgánicos en distintos metabolitos productos de fermentación, lo que va a acompañado por la liberación de H2. Es llevada a cabo por microorganismos anaerobios estrictos, como Clostridium o Syntrophobacter, o facultativos, como Enterobacter y otras bacterias entéricas. Entre las ventajas más importantes de la producción de H2 por fermentación acida, cuando se compara con otros procesos, se encuentran la sencillez del mismo, tasas de producción elevada, y la posibilidad de utilizar residuos de bajo valor como materia prima. Uno de sus principales problemas es que su producción se inhibe debido a la presión parcial del H2 acumulado. En efecto, si esta presión alcanza ciertos valores, las sintrofobacterias se inhiben y las bacterias como Clostridium cambian su metabolismo para consumir los equivalentes redox. Así, Clostridium spp. producen H2, CO2, acetato y butirato durante la fase de crecimiento inicial (fase acidogénica), causando así una disminución del pH del medio. Debido tanto a esta bajada de pH como a la acumulación de H2, el metabolismo microbiano sufre un cambio que se manifiesta en la producción de disolventes, como el etanol y butanol, más reducidos que los ácidos correspondientes. Durante la digestión anaerobia de la materia orgánica, el H2 producido es eliminado por consumidores de H2, principalmente arqueas metanogénicas. Por ello, si se quiere obtener H2 como lo producto final, éstas deben suprimirse o inhibirse. En resumen, para una producción eficiente de H2 deben evitarse tanto la metanogénesis como su acumulación. Una posible solución para atajar este último problema es su extracción aplicando vacío. Se han utilizado numerosos inóculos como fuente de microorganismos productores de H2: lodo de digestores de fangos, lodos de alcantarillado, estiércol de diferentes orígenes, compost, suelos agrícolas, depósitos fluviales, etc. Entre ellos, se puede considerar el lodo granular anaerobio, procedente de reactores UASB, como una de las mejores fuentes de bacterias productoras de H2, tanto por su alta biodiversidad, a partir de él se han aislado varios clostridios y sintrofobacterias, como por su enorme concentración bacteriana (Fang et al, 2002; Lee et al, 2004; Hu y Chen, 2007). Entre los diversos factores que afectan a la producción de H2, el pH y la temperatura juegan un papel crítico, afectando tanto al crecimiento como a la actividad de las hidrogenasas (Wang y Wan, 2008; Tang et al, 2008; Koskinen et al, 2008 Jo et al, 2008). El sustrato empleado es otro factor importante a considerar. Existen múltiples estudios relativos a la fermentación oscura utilizando glucosa y sacarosa, altamente biodegradables (Lin et al, 2006; Chu et al, 2010). Sin embargo, su coste es demasiado elevado para que el proceso sea rentable. Por ello , la conversión microbiana de residuos agrícolas e industriales en H2 resulta sumamente atractiva al reducir los costes de producción (Lee et al, 2010). Esta Tesis tiene por objeto estudiar la producción de H2 por fermentación acida mediante bacterias aisladas e identificadas en la misma. Para ello se han estudiado diversos factores que la favorecen, tales como el pH, la temperatura y el substrato de modo que puedan alcanzarse mayores rendimientos, determinando el efecto que la aplicación de vacío pueda tener sobre el metabolismo de los productores de H2. De H2 partiendo de cuatro fuentes diferentes, optimizándose el pH y la temperatura para maximizar la producción H2, tanto por los aislados como por un cultivo enriquecido obtenido a partir de lodo granular. En todos los casos se identificaron y cuantificaron los productos finales de la fermentación. La segunda parte de nuestro estudio parte de la premisa de que algunas bacterias productoras fermentan preferentemente proteínas mientras que otras prefieren azúcares. En el trabajo desarrollado se pretendía comprender el efecto de diferentes sustratos tienen sobre la producción de H2 mediante fermentación acida. Para ello se emplearon siete substratos diferentes: cuatro medios sintéticos y tres aguas residuales reales, utilizando lodo granular anaerobio como inoculo. En el trabajo se estudió, además, el efecto de la extracción del H2 mediante vacio, las rutas metabólicas implicadas y la estructura de comunidades microbianas, determinada mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). La tercera parte del trabajo se centró en el estudio de las interacciones entre las diferentes cepas aisladas y, especialmente, en la formación de consorcios microbianos entre las cepas productoras de H2 y una bacteria aerobia, también aislada en el transcurso de la Tesis, capaz de formar gránulos que embeben a las productoras, lo que puede tener alto interés para su aplicación a nivel industrial. Como inóculo para el aislamiento de bacterias productoras de H2 se utilizaron las siguientes fuentes: i) lodo granular anaerobio de un reactor UASB que trata las aguas residuales de una cervecera (Mahou SA, Alovera); ii) lodo de un digestor de biometanización que trata residuos sólidos urbanos (Valdemingómez, Madrid); iii) lodo de una depuradora de fangos activos que trata aguas residuales domésticas (Universidad Autónoma de Madrid); iv) sedimentos anaerobios de un río (Tinto, Huelva). A lo largo del trabajo se emplearon múltiples medios con diferente composición en función de lo que se quisiera estudiar. En los trabajos de aislamiento, optimización del pH y temperatura, comportamiento de los consorcios, etc., se empleó un medio sintético [MR] que incluye como fuente de carbono tanto azúcares como proteínas (mg l-1): 280 NH4CL, 328 K2HPO4, 100 MgSO4, 500 NaHCO3, 2000 Sacarosa, 1000 extracto de carne, 500 extracto de levadura y 1 ml de solución micronutriente (Sanz et al., 1996). En otros estudios se han empleado diferentes medios, tanto sintéticos: medio glucosa [MG], medio extracto de carne [ME], medio con aceite de oliva [MO], como aguas residuales reales: de cervecera [IW1], de una empresa de recuperación de aceites industriales usados [IW2], y aguas residuales domésticas [DW]. Por lo que se refiere a las técnicas analíticas empleadas en esta Tesis, el H2 y el CH4 se cuantificaron mediante cromatografía de gases utilizando cromatógrafos Bruker 450GC y GC Varian Star 3400CX, respectivamente. Los azúcares, ácidos grasos volátiles y otros productos de fermentación se analizaron mediante HPLC (Varian Prostar 350). La DQO, pH, etc., se midieron según se describe en el manual Standar Methods for Examination of Water and Wastewater (1988). La comunidad microbiana se analizó mediante DGGE. A partir de los cuatro tipos de inóculos antes citados, y utilizando el vacío como presión selectiva, se aislaron diez cepas bacterianas altamente productoras del H2. Tras la amplificación y secuenciación del 16S rRNA se vio que todas ellas pertenecían al género Clostridium, reconocido como el más importante productor de H2 mediante fermentación oscura. El pH inicial y la temperatura óptimos para el crecimiento de los aislados y alcanzar la máxima producción de H2 fueron, en muchos pero no todos los casos, de 6,5 y 35 °C. Las variaciones en ambos parámetros tuvieron diferente incidencia sobre las distintas cepas. En todos los casos la producción de H2 fue concomitante con el crecimiento de las cepas y un descenso del pH hasta valores de 4,5-5. Este descenso es debido a la producción de ácidos orgánicos, principalmente butirato y acetato (en proporciones que dependen de la cepa y condiciones), productos finales de la fermentación butírica, que fue la predominante. La producción de H2 se ve influenciada por múltiples factores, entre los que se incluyen el tipo de inoculo, el pH, la temperatura y el substrato. Por eso, no es fácil de comparar los rendimientos de producción H2 entre los diferentes trabajos publicados. C. roseum H5 y C. diolis RT2 presentaron los rendimientos más altos (120 mL-H2 g-1 CODinicial). Si se considera sólo el sustrato consumido, C. beijerinckii UAM y C. diolis RT2 alcanzaron los 573 y 475 mL-H2 g-1 DQOeliminada, con rendimientos para las diferentes cepas entre 2 y 4 moles de H2 por mol de glucosa, superiores, en muchos casos, a los rendimientos publicados. Partiendo de la hipótesis de que el lodo granular es una fuente óptima de organismos productores de H2 y que, a partir de él pueden obtenerse cultivos enriquecidos altamente productores, se estudió la respuesta del mismo ante diferentes substratos tanto sintéticos como aguas residuales reales, y el efecto que el vacío podría tener sobre los metabolismos fermentativos de los organismos que lo componen. Observamos que, dependiendo del sustrato suministrado, las rutas fermentativas dominantes variaban, prevaleciendo las fermentaciones ácido-mixta [MG, IW2], homo [MO] y heteroláctica [MR, MG], butírica [DW], propiónica [IW1, ME] y la reacción de Stikland para la degradación de aminoácidos [ME]. Cuando se aplica vacío, propionato, butirato y etanol pueden ser oxidados a acetato, liberando H2. Si el proceso continúa ambos, acetato e H2, pueden ser convertidos en CH4, con la consiguiente reducción drástica de la DQO final. Por ejemplo, en [MR] la glucosa es convertida en ácido láctico y etanol y dióxido de carbono (ec. 1). Posteriormente el lactato es convertido en en dióxido de carbono y etanol (ec. 2), el cual es oxidado en acetato e hidrógeno (ec. 3) que pueden ser convertidos en metano: C6H12O6 ¿ CH3-CHOH-COOH + CH3-CH2OH + CO2 (ec. 1) CH3-CHOH-COOH ¿ CH3-CH2OH + CO2 (ec. 2) CH3-CH2OH + H2O ¿ CH3-COOH + 2H2 (ec. 3 ) La biodiversidad microbiana fue analizada por medio de DGGE. Las bacterias predominantes (Clostridium, Klebsiella, Acetobacter, Arcobacter, Desulfovibrio, Dysgonomonas) dependen del sustrato utilizado. Por lo que se refiere al dominio arquea, tan sólo se encontraron dos géneros de metanobacterias, ambas acetoclásticas: Methanosaeta, que parece estar presente en todos los casos independientemente del sustrato, lo que concuerda con su abundancia en el lodo granular (Diaz et al, 2006), y Methanosarcina. Considerando que los clostridios pueden ser sacarolíticos, proteolíticos o ambas cosas, nos planteamos estudiar la especificidad de las diferentes cepas aisladas con objeto de ver el efecto sinérgico de co-cultivos sobre la degradación de sustratos mixtos, como una aproximación a la utilización aguas residuales como sustrato para la producción de H2. Los mejores co-cultivos fueron los formados por C. roseum H5 (degradador de proteínas) y C. butyricum R4 ó C. saccharobutylicum H1 (ambos consumidores de glucosa). A partir lodo granular se aisló una bacteria aerobia, identificada como Streptomyces sp., capaz de crecer en determinadas condiciones formando gránulos. Ante el potencial interés que estos pudieran tener, tanto como consumidores del oxígeno disuelto, lo que elimina la necesidad de añadir agentes reductores al medio, como la posibilidad de acumular grandes cantidades de biomasa en un biorreactor haciendo independiente el tiempo de residencia hidráulico del tiempo de residencia de las bacterias, se estudió la formación de consorcios entre el Streptomyces y los clostridios productores de H2. Se observó un aumento significativo en el rendimiento en H2, y se modificaron ligeramente los patrones de fermentación, si bien el butirato siguió siendo el principal producto de fermentación, seguido de acetato y, en menor cuantía, propionato. Puesto que la acumulación de ácidos y el consiguiente descenso del pH inhibe la posterior formación de H2 y sólo reduce en un 20-30% la carga orgánica, se añadieron al consorcio una bacteria degradadora de butirato (Syntrophobacter wolinii) y una metanógena acetoclástica (Methanosaeta concilii). Este nuevo consorcio permitiría, en una segunda etapa tras la producción de H2, producir CH4 y reducir la carga orgánica del efluente. Los resultados obtenidos en esta tesis han permitido redactar tres artículos, enviados para su publicación en destacadas revistas del área, y a una patente presentada en la Agencia Española de Patentes y Marcas. Como continuación del trabajo, los conocimientos adquiridos en el mismo se están aplicando a estudios sobre la producción de H2 en biorreactores. A partir de aguas residuales se espera poder alcanzar buenos rendimientos en la producción de H2, CH4 en una segunda etapa y obtener un efluente limpio que permita la aplicación de los mismos a nivel industrial.