Interaction between conjugated polyelectrolytes and biological systemscharacterisation and biotechnological applications

Resumen

Los polielectrolitos conjugados fluorescentes (CPEs) presentan propiedades muy interesantes. Se trata de polímeros que poseen esqueletos con enlaces π-conjugados y que muestran altos coeficientes de extinción y un elevado rendimiento cuántico de fluorescencia. Además, poseen cadenas laterales que contienen grupos cargados para facilitar su solubilidad en medios acuosos. Estas propiedades pueden ser utilizadas para estudiar interacciones con biomoléculas, tales como proteínas y ADN, con objeto de desarrollar plataformas sensoriales y nuevas herramientas de bioimagen. En la presente Tesis se han caracterizado dos CPEs catiónicos que emiten en diferentes regiones espectrales: HTMA-PFP, con emisión en el azul, y HTMA-PFNT, que emite en el rojo. Además se han explorado sus posibles aplicaciones en el campo de la biotecnología. En aplicaciones biomédicas, como es la bioimagen, un requisito indispensable es la solubilidad del CPE en medio acuoso. Por ello, en la primera parte de esta Tesis se ha explorado el comportamiento de los dos polímeros, HTMA-PFP y HTMA-PFNT, en disolución acuosa. A continuación, se ha investigado la interacción de los CPEs con modelos de membrana formados por lípidos aniónicos y zwitteriónicos, con objeto de evaluar la capacidad de utilizar estos polielectrolitos como marcadores fluorescentes de membrana. Este estudio demostró que ambos compuestos presentan una mayor afinidad y selectividad hacia lípidos aniónicos, que son el componente mayoritario de las membranas bacterianas. Teniendo en cuenta este resultado, se llevó a cabo un estudio en el que se modelizaron membranas de mamífero y bacteriana con diferentes mezclas lipídicas y se exploró cómo interaccionan HTMA-PFP y HTMA-PFNT con estos sistemas. Dicho estudio confirmó la preferencia de los CPEs, especialmente HTMA-PFNT, por los modelos bacterianos. Experimentos preliminares realizados con bacterias y células de mamífero soportaron estos resultados, mostrando que en muestras donde coexisten ambos tipos de células, HTMA-PFNT únicamente marca las células bacterianas. Este experimento evidencia la posible utilización de HTMA-PFNT como una herramienta para el diagnóstico y bioimagen de contaminación bacteriana. Además, se ha estudiado la capacidad de ambos polielectrolitos para formar nanoestructuras fluorescentes estables en medio acuoso y se han explorado sus aplicaciones. Por un lado, se investigó la interacción de HTMA-PFNT con dos sistemas biológicos utilizados frecuentemente como nanotransportadores: la proteína HSA y vesículas liposomales. Así, se obtuvieron nanopartículas que emiten en el rojo y que preservan las propiedades funcionales de los sistemas biológicos que las componen. Estas nanopartículas multifuncionales fueron capaces de transportar compuestos polares e hidrofóbicos y han podido ser utilizadas como sondas fluorescentes en bioimagen. Por otro lado, también se han obtenido nanopartículas fluorescentes que emiten en el azul, a través de la interacción del polielectrolito HTMA-PFP y vesículas liposomales aniónicas. Estas nanopartículas han sido caracterizadas en detalle y acopladas a la enzima fosfatasa alcalina, con objeto de desarrollar un biosensor para la determinación de inhibidores de esta enzima. Los componentes del biosensor (nanopartículas y enzimas) se han inmovilizado en una matriz sol-gel, para facilitar su manipulación y permitir su reutilización. El biosensor ha sido optimizado para la determinación de ion fosfato, un inhibidor competitivo de la enzima.