Caracterización del receptor nicotínico neuronal a3ß4 expresado en ovocitos de Xenopus: Un estudio estequiométrico

Résumé

Nuestro grupo de investigación viene trabajando desde hace años en la identificación y caracterización de la estructura y función secretora del receptor nicotínico de la célula cromafín bovina, desde el punto de vista electrofisiológico, farmacológico y funcional. Una de las inquietudes del grupo es conocer la composición de subunidades del receptor nicotínico, así como la estequiometría del mismo en este modelo celular que viene siendo utilizado de manera rutinaria. Como ya se ha comentado anteriormente, la célula cromafín bovina posee ARNm codificante para las subunidades alfa3, alfa5, alfa7 y beta4 (Criado et al., 1992; García-Guzmán et al., 1995; Campos-Caro et al., 1997; Wenger et al., 1997), aunque no se ha demostrado aún si todas estas subunidades se asocian para dar lugar a un receptor complejo alfa3beta4alfa5alfa7 o si pueden existir diferentes combinaciones de estas subunidades para formar distintas subpoblaciones de receptores en la membrana de la célula cromafín bovina, como pueden ser receptores de subtipo alfa7 y receptores de subtipo alfa3beta4alfa5. A pesar de que existen datos, tanto en la literatura (Criado et al., 1997; El-Hajj et al., 2007), como en nuestro propio grupo de investigación de la presencia de receptores alfa7 en la membrana celular de la célula cromafín bovina, todavía no ha sido posible demostrar de forma directa su posible papel funcional. Las evidencias farmacológicas que el grupo ha aportado a lo largo de los últimos años no evidencian la existencia de un receptor homomérico alfa7 (Maneu et al., 2002; Rojo, 2007; Escalona, 2009). Así, el objetivo general de esta tesis es caracterizar desde el punto de vista electrofisiológico, farmacológico, cinético, molecular y funcional los posibles subtipos de receptores nicotínicos presentes en la membrana de la célula cromafín bovina, mediante su expresión heteróloga en ovocitos de Xenopus laevis. Para ello, nos hemos servido de la oxotremorina-M como herramienta farmacológica y se ha caracterizado sobre distintos subtipos de nAChRs en un intento de encontrar un agonista capaz de discriminar entre los receptores alfa7 homoméricos y receptores alfa3beta4 heteroméricos, debido a que hasta la fecha no se han descrito agonistas selectivos para este último subtipo. La oxo-M se ha descrito como un potente agonista muscarínico (Cho et al., 1962; Lin y Phillis, 1991), aunque se ha descrito su acción nicotínica en múltiples sistemas (Haggblad et al., 1985; Hong y Chang, 1990; Reitstetter et al., 1994; Akk y Auerbach, 1999). Por otro lado, basándonos en la existencia de dos estequiometrías alternativas para el receptor alfa4beta2, descrito por primera vez por Nelson y col., 2003, hemos explorado esta posibilidad en relación al receptor alfa3beta4, lo que podría explicar el motivo de las diferencias entre los resultados obtenidos en los sistemas de expresión heteróloga y en la célula cromafín bovina. Teniendo en cuenta trabajos previos sobre otros miembros de la familia de receptores nicotínicos, hemos utilizado la inyección de proporciones extremas de las subunidades alfa3 y beta4 para la expresión de receptores con dos o tres subunidades ¿. Además, se han utilizado diversas herramientas farmacológicas como agonistas (ACh y oxo-M) y moduladores (zinc) para discriminar entre las dos formas del receptor, junto con técnicas electrofisiológicas (registros de fijación de doble electrodo y registros de canal único) para realizar la caracterización de ambos receptores. Basándonos en los resultados obtenidos de la caracterización de los receptores expresados en nuestro sistema de expresión heteróloga, hemos utilizado las herramientas farmacológicas oxo-M y zinc para caracterizar la estequiometría de los nAChRs nativos presentes en la célula cromafín bovina, mediante el uso de la técnica electrofisiológica de patch-clamp Una vez demostrada la existencia de las dos estequiometrías alternativas del receptor alfa3beta4 se hace evidente la importancia de trabajar con receptores con una composición de subunidades bien definida. Por este motivo, se crearon y caracterizaron receptores con subunidades concatenadas, ordenadas de una forma predeterminada, utilizando técnicas de biología molecular. Esta tesis no solo contribuye a una mejor compresión sobre las propiedades del receptor alfa3beta4 y del posible receptor presente en la célula cromafín bovina, sino también a un mayor entendimiento de la función del receptor alfa3beta4, mostrando el camino para futuros trabajos tales como: a) desarrollo de moléculas selectivas a una estequiometría concreta. b) comprensión del papel modulador ejercido por el Zn2+ sobre los nAChRs en las terminales presinápticas. c) ¿los cambios estequiométricos participan en el mecanismo celular de la comunicación neuronal o son solo artefactos de los sistemas heterólogos?