NAD+-glutamato deshidrogenasa de Thermus thermophilus HB8propiedades moleculares, clonaje y expresión

Resum

Se ha purificado la NAD+ -glutamato deshidrogenasa de la bacteria termófila Thermus termophilus HB8. La estructura de la proteína es un hexámero de 280 Kda. Presenta un óptimo de actividad enximática en el tampón Tris/HC1 50mM, EDTA 2mM a pH8. La enzima es estable entre 65 y 75º C con un óptimo a 72º C, presentado un tiempo de vida media de 0,32 horas a 85º C. sE han realizxado estudios de fluorescencia que demuestran la naturaleza compacta de la proteína. La urea no actúa como agente desnaturalizante para la GDH de T. Thermophilus. La proteína presenta un mecanismo de velocidades iniciales secuencial donse el coenzima NAD+ es el primero en unirse ala enzima y el producto NADH el último en liberarse. Empleando un producto de PCR de 300 pb. Se ha clonado y secuenciado un gen que codifica para glutamato dehidrogenasa de t. Thermophilus HB8. De forma continuay corriente abajo a este gen, aparece otro que codifica para otra glutamato deshidrogenasa. sE ha construido un modelo estructural para la glutamajto deshodrogenosa secuenciada. Se ha expresado el gen en células de E. Coli BL21 (DE3) utilizando los vectores de expresión citoplasmáticos pET-3a y pET-14 b.