Rhizomodulation for tomato growth promotion and management of root knot nematodes using Pochonia chlamydosporia and chitosan

Resumen

Muchos microorganismos como procariotas, virus u hongos interactúan con las plantas. Las interacciones de los hongos con las plantas son las más estudiadas principalmente por su impacto negativo ya que más de 10.000 especies de hongos causan enfermedades vegetales (Agrios, 2005). Por otra parte, debido a la larga co-evolución entre plantas y hongos, muchos hongos son mutualistas de plantas, destacando micorrizas y otros endófitos. Existe una amplia diversidad fúngica. Los hongos son organismos que pueden ocupar diversos nichos ecológicos y cumplen funciones esenciales, tanto en ecosistemas naturales como agrícolas. Los ¿hongos superiores¿ engloban a los filos Basidiomycota y Ascomycota. Dentro de los Basidiomycota existen unas 30.000 especies; algunos de los organismos más conocidos son las setas y las royas (Kirk et al., 2001). Uno de los filos más diversos y de más amplia distribución son los Ascomycota, que engloban a unas 64.000 especies. Los hay de diferentes modos de vida: saprotróficos, patógenos de animales, líquenes, micoparásitos y hongos asociados con plantas como patógenos, micorrizas y otros endófitos no patógenos. Algunos de estos hongos se han utilizado como organismos modelo (Schoch et al., 2009). Los Hongos y los Oomicetos (Chromista) son los principales eucariotas patógenos de plantas. Estos organismos poseen diferentes modos de vida: los Biotrofos, que se alimentan y completan su ciclo de vida en los tejidos de plantas vivas; los Necrotrofos, que matan a las células de su huésped antes de alimentarse de las mismas y los Hemibiotrofos, que primero se desarrollan en las células vivas para después matarlas y finalmente colonizar los tejidos muertos (Agrios, 2005). Los hongos Biotrofos y los Hemibiotróficos, poseen estrategias comunes para causar infecciones en las plantas. En primer lugar invaden el tejido de la planta por medio de apresorios o través de los estomas causando un daño mínimo en el huésped, evadiendo de esta forma las defensas de las plantas (Oliveira y Valent, 2015). Para ello, además segregan efectores, moléculas capaces de modificar las estructuras celulares, el metabolismo y la fisiología de las plantas. De esta manera los hongos alteran la activación normal de las defensas vegetales (Giraldo y Valent, 2013). Los principales cultivos de importancia alimenticia con distribución mundial como el maíz (Zea mays L.), el arroz (Oryza sativa L.), el trigo (Triticum spp.), la patata (Solanum tuberosum L.) o el tomate (Solanum lycopersicum L.) se ven afectados por hongos fitopatógenos (FAOSTAT, 2015). El ascomiceto Magnaporthe oryzae es un hemibiotrofo que afecta principalmente al arroz, aunque también se ha descrito infectando al trigo o a la cebada (Talbot, 2003). El ascomiceto Gaeumannomyces graminis var. tritici es un hongo necrotrófico que causa el ¿pie negro¿, la principal enfermedad radicular del trigo. También puede afectar a la cebada y posiblemente es la enfermedad radicular más estudiada en los cultivos. El basidiomiceto Ustilago maydis es un hongo biotrófico, que afecta al maíz (Dean et al., 2012). El ascomiceto Fusarium oxysporum es un patógeno facultativo de animales y plantas, aunque también puede vivir en el suelo de forma saprotrófica. El término Simbiosis se propuso por A. de Bary en 1879 para definir ¿la convivencia entre organismos diversos¿. Hay tres clases principales de simbiosis: el mutualismo, donde ambos organismos se ven beneficiados; el comensalismo, donde uno (patógeno o parásito) de los organismos involucrados se beneficia en gran medida de la relación simbiótica, mientras que el otro es perjudicado o dañado; y el último, el parasitismo, donde uno se ve beneficiado por la simbiosis sin embargo, el otro organismo (huésped u hospedador) se ve perjudicado. El mutualismo entre plantas y hongos fue un paso esencial para la colonización del medio terrestre por las primeras plantas, así como para su evolución posterior. Las principales asociaciones simbióticas de hongos son los líquenes, las micorrizas y los endófitos. La mayoría de las plantas en la naturaleza poseen micorrizas y/o endófitos fúngicos (Rodríguez et al., 2009). En los líquenes, los hongos suelen establecer relaciones simbióticas con algas verdes o cianobacterias. Las micorrizas son asociaciones de hongos con raíces, que ayudan a las plantas a tomar nutrientes del suelo, y representan una parte esencial del Ciclo global del Carbono. Las más extendidas son las Micorrizas Arbusculares (AM), seguidas de las Ectomicorrizas (ECM) (Brundrett, 2002). Endófito literalmente significa ¿en la planta¿ (endon.: dentro, Phyton: planta). Los hongos endófitos se han definido como microorganismos que están presentes en órganos de la planta sin causar síntomas en el momento de su detección (Petrini, 1991). La mayoría de los hongos endófitos pertenecen a los Ascomycota. Los hongos endófitos, al igual que los hongos fitopatógenos, pueden penetrar en las plantas directamente con apresorios o través de aberturas naturales como estomas. En las zonas de penetración de los hongos endófitos se han observado respuestas típicas de la planta, similares a las producidas por los hongos fitopatógenos como la formación de papilas (Cabral et al., 1993) o el aumento de la producción de peróxido de hidrógeno (Peters et al., 1998). De alguna manera es desconcertante por qué un organismo puede permanecer en los tejidos del huésped sin causar ningún daño. Schulz y Boyle (2005) llegaron a la conclusión de que sólo es posible el endofitismo cuando se establece una relación equilibrada entre el hongo y la planta, es decir, cuando ocurre una colonización asintomática. Los organismos que poseen estas relaciones equilibradas con la planta poseen una mayor plasticidad biológica que los patógenos. Se han descrito numerosos beneficios de los hongos endófitos a la planta huésped. Entre ellos podemos destacar la inducción de metabolitos de defensa de las plantas frente a patógenos (Arnold et al., 2003), la secreción de fitohormonas (Tudzynski y Sharon, 2002) o la mejora en la adaptabilidad frente a estreses abióticos tales como altas temperaturas (Redman et al., 2002) o la salinidad (Rodríguez et al., 2008). Los endófitos también protegen a las plantas frente a estrés de tipo biótico como el causado por los patógenos (Maciá-Vicente et al., 2008). Asimismo, los endófitos promueven el crecimiento de las plantas (Maciá-Vicente et al., 2009a) o su desarrollo (Zavala-González et al., 2015). El Filo Nematoda incluye animales vermiformes de tamaño microscópico con distribución mundial. Son los principales componentes de la biota del suelo. Los nematodos son uno de los animales más abundantes en la biosfera, con aproximadamente 25.000 spp. descritas (Zhang, 2013), aunque se estima una diversidad oculta muchísimo mayor, pudiendo llegar a un millón de especies (Blaxter, 2003). La mayoría de los nematodos son de vida libre y recirculan los elementos minerales y componentes orgánicos del suelo y de los sedimentos marinos. Los nematodos parásitos de animales y plantas se estudian en detalle debido al daño que causan, el peligro que suponen para la salud humana/animal y las pérdidas que generan en la agricultura. La mayoría de los nematodos parásitos de plantas (NPP) pertenecen al orden Tylenchida y causan enfermedades en la mayoría de los cultivos a nivel mundial. Las estimaciones de las pérdidas de cosechas debido a NPP van del 5% al 15% y se han estimado en 80 mil millones de dólares al año a nivel mundial (Nicol et al., 2011). Los NPP son biotrofos y la mayoría patógenos radiculares que poseen diversas estrategias de alimentación. Hay dos principales tipos de NPP, los ecto- y los endoparásitos. Los endoparásitos también pueden ser migratorios, causando daño a lo largo de la raíz, sin embargo la mayoría de las especies son sedentarias. Los endoparásitos sedentarios desarrollan un sitio de alimentación fijo en las raíces de sus huéspedes (Jenkins y Taylor, 1967). Los NPP tienen un estilete, que es una herramienta para su alimentación situada en la cabeza del nematodo. Dicho estilete se utiliza para obtener los nutrientes de la planta y para la inyección de efectores en las células radiculares. Los NPP también utilizan estos efectores (pequeñas proteínas secretadas) para bloquear las defensas de las plantas (Quentin et al., 2013). Las secreciones de los nematodos también imitan las hormonas vegetales (Bird et al., 2014). Las secuencias genómicas de varios NPP como Meloidogyne incognita (Abad et al., 2008), M. hapla (Opperman et al., 2008) o Bursaphelenchus xylophilus (Kikuchi et al., 2011) revelan similitudes entre los nematodos y los hongos fitopatógenos. De hecho, ambos tienen en común la secreción de enzimas degradadoras de la pared celular vegetal y los efectores (Bird et al., 2014). La mayoría de las pérdidas agrícolas están causadas por los nematodos endoparásitos formadores de agallas (Meloidogyne spp.) y los de quistes (Heterodera y Globodera spp.). Los NPP llamados ¿agalladores¿ pertenecen al género Meloidogyne spp. Estos nematodos radiculares están presentes sobre todo en zonas con climas cálidos o inviernos cortos y en cultivos de invernadero (Agrios, 2005). Las especies más importantes son M. arenaria, M. incognita y M. javanica en zonas tropicales y subtropicales y M. hapla en climas templados (Jones et al., 2013). Más de 2000 especies de plantas, que incluyen casi todas las familias de plantas, se ven afectadas por Meloidogyne spp. Los cultivos de mayor importancia económica también se ven afectados por al menos una especie de este género (Jenkins y Taylor, 1967; Sasser y Carter, 1985). El tomate, principal cultivo en la cuenca Mediterránea (Ornat y Sorribas, 2008), es un buen huésped para los nematodos del género Meloidogyne (Netscher y de Lucas, 1974). En Meloidogyne spp. existe un dimorfismo sexual marcado. Los machos son vermiformes y miden entre 1,2-1,5 mm de longitud y 30-36 micras de ancho. Sin embargo, las hembras tienen forma piriforme de 0,4 a 1,3 mm de largo y de 270 a 750 micras de ancho. Cada hembra de Meloidogyne spp. pone de 300 a 500 huevos en una matriz gelatinosa. En condiciones favorables, los nematodos sufren una primera muda en el interior del huevo. Cuando las condiciones de humedad y temperatura son favorables tiene lugar la eclosión del huevo, y en consecuencia la salida del mismo del juvenil de estadio 2 conocido como J2. Los J2 son la única etapa infectiva del nematodo. Cuando un J2 encuentra una planta huésped, penetra en la raíz con su estilete y migra hacia el cilindro vascular donde se inducen los sitios de alimentación. Las secreciones de los nematodos estimulan el crecimiento de las células subyacentes a los mismos mediante la estimulación de la mitosis sin citocinesis, formando de esta manera células metabólicamente muy activas, multinucleadas, comúnmente conocidas como ¿Células Gigantes¿. Dentro de la raíz, el nematodo se convierte en una forma sésil que sufre varias mudas (J2, J3 y J4), llevándose a cabo la diferenciación sexual de los adultos. Los machos se producen ocasionalmente; emergen de la raíz y son de vida libre. La mayoría de los J2 originan hembras y éstas permanecen como endoparásitos sedentarios. El ciclo se completa cuando la hembra pone los huevos en la matriz gelatinosa mediante partenogénesis, es decir, sin fertilización masculina. Los machos no juegan un papel importante en el ciclo biológico de los nematodos agalladores y la reproducción sexual sólo tienen lugar bajo condiciones ambientales desfavorables. El ciclo biológico de Meloidogyne spp. puede durar entre 20-30 días dependiendo de las condiciones ambientales, principalmente de la temperatura (Tyler, 1933). Los huevos de nematodos son capaces de sobrevivir en condiciones adversas. La cubierta del huevo es la estructura que protege a los juveniles infectivos (J2). La cubierta de M. javaniva posee tres capas: la lipídica, la quitinosa y por último la capa vitelina. La capa vitelina es similar a una membrana y forma la capa externa de la cubierta del huevo. La capa quitinosa proporciona resistencia estructural, siendo la más gruesa de las tres y la única estructura del nematodo que contiene quitina. Las proteínas constituyen el 50% de la cubierta del huevo junto a microfibrillas de quitina (30%). Esta estructura macromolecular le proporciona al huevo tanto flexibilidad como resistencia (Bird y McClure, 1976). La capa lipídica confiere impermeabilidad, pero se hidroliza antes de la eclosión de los juveniles del nematodo (Bird y Bird, 1991). Se han empleado diferentes métodos para el manejo de nematodos, tales como el uso de nematicidas y fumigantes, la rotación de cultivos, la utilización de cultivos resistentes, así como el control biológico. Hace décadas lo más común para el manejo de nematodos era el uso de nematicidas y fumigantes, sin embargo, debido a su impacto negativo sobre el medio ambiente y a los residuos tóxicos que generan, su uso se está limitando e incluso está siendo prohibido en muchos casos (Collange et al., 2011). La rotación de cultivos para el manejo de Meloidogyne spp. es difícil ya que muchos cultivos son susceptibles y es difícil encontrar variedades resistentes (Jenkins y Taylor, 1967). La resistencia a Meloidogyne spp. se ha desarrollado en tomate mediante la introducción del gen Mi de Solanum peruvianum (Smith, 1944). Generalmente, el producto del gen Mi reconoce un efector esencial del nematodo y activa las defensas vegetales (Davies y Elling, 2.015). Sin embargo, Meloidogyne spp. puede romper la resistencia por el gen Mi cuando el suelo alcanza altas temperaturas (Holtzmann, 1965). Por lo tanto, los genes de resistencia deben utilizarse como una herramienta de gestión integrada de Meloidogyne spp. para evitar la aparición de poblaciones resistentes. Sin embargo, los nematodos fitoparásitos no pueden considerarse aislados del resto de organismos del suelo. Además, sus actividades y dinámica poblacional también se ven influenciadas, directa e indirectamente, no sólo por los organismos circundantes, sino también por diversas propiedades físicoquímicas del suelo, así como por factores ambientales como humedad y temperatura (Costa et al., 2011;. Stirling, 2011). Hay suelos agrícolas, conocidos como suelos supresivos, donde los nematodos fitopatógenos no causan daños a los cultivos susceptibles. En ellos los microorganismos del suelo, tales como hongos nematófagos, infectan a los nematodos (Stirling, 2014). Los hongos nematófagos son el grupo más diverso de antagonistas de nematodos. Se encuentran en diferentes grupos taxonómicos y utilizan diversos mecanismos para capturar y matar a los nematodos (Stirling, 2014). Se dividen en cuatro grupos en función al modo que tienen para parasitar a los nematodos: los nematodos atrapadores (también llamados hongos depredadores), los endoparásitos, los parásitos de hembras y huevos y por último los hongos productores de toxinas (Jansson y López-Llorca, 2001). En todos los casos, el resultado es un nematodo completamente digerido, lo que suministra al hongo nutrientes y energía (López-Llorca et al., 2008). Los hongos atrapadores han desarrollado sofisticadas estructuras de captura en las que los nematodos quedan capturados por adhesión o mecánicamente (Nordbring-Hertz et al., 2006). La mayoría de los hongos atrapadores son Ascomycetos (Orden Orbiliales). Los hongos endoparásitos utilizan sus esporas (conidios o zoosporas) para infectar a los nematodos. Las esporas se adhieren a la cutícula de los nematodos, su contenido se inyecta en el nematodo, o el nematodo las ingiere. Los nematodos parásitos de hembras y huevos de nematodos infectan mediante apresorios (Pochonia spp., Paecilomyces spp.) o zoosporas (Nematophthora spp) (López-Llorca et al., 2008). Finalmente, los hongos productores de toxinas inmovilizan a los nemátodos antes de su penetración a través de la cutícula de los mismos. El hongo nematófago Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y Gams es un parásito de hembras y huevos de nematodos (Kerry, 2000). El hongo se ha encontrado en suelos supresivos a nivel mundial. En primer lugar se encontró parasitando quistes de Heterodera spp. (Willcox y Tribe, 1974) y posteriormente en huevos de Meloidogyne spp. (Verdejo-Lucas et al., 2002). Pochonia chlamydosporia se ha utilizado ampliamente en macetas y experimentos de invernadero para el manejo de nematodos fitopatógenos incluyendo el género Meloidogyne spp. Por lo general, las clamidosporas (esporas de resistencia) del hongo se han aplicado a una dosis de 5000 clamidosporas por gramo de suelo (Atkins et al., 2003; Bourne et al., 1996; Bourne y Kerry, 1999, Tzortzakakis, 2.000; Verdejo-Lucas et al., 2003). P. chlamydosporia puede sobrevivir en ausencia de nematodos como hongo saprófito del suelo. Pochonia chlamydosporia posee una alta actividad proteolítica y capacidad parasítica de huevos de Meloidogyne javanica (Olivares-Bernabeu y López-Llorca, 2002, Esteves et al., 2009). Además, P. chlamydosporia forma apresorios para adherirse y penetrar huevos de nematodos (López-Llorca y Claugher, 1990). P. chlamydosporia es también un endófito de importantes cultivos como el tomate (Bordallo et al., 2002), la cebada (Maciá-Vicente et al., 2009a) o la patata (Manzanilla-López et al., 2011). Cuando el hongo está colonizando las raíces de las plantas induce defensas bioquímicas (Larriba et al., 2015), estructuras de defensa (Bordallo et al., 2002) y además promueve el crecimiento de la planta, principalmente el radicular (Maciá-Vicente et al., 2009a; Monfort et al., 2005; Zavala et al., 2015). La colonización endofítica radicular puede ser una estrategia de supervivencia para P. chlamydosporia ya que en algunas situaciones el hongo posee baja receptividad en el suelo (Monfort et al., 2006). La competencia rizosférica de P. chlamydosporia varía en función del aislado fúngico (Bourne et al., 1996, Kerry y Bourne, 1999). Se ha descrito que Pochonia spp. expresa proteasas involucradas en el parasitismo de nematodos cuando el hongo está colonizando de forma endofítica raíces de cebada (López-Llorca et al., 2010). Por lo tanto, la colonización endofítica puede ser una estrategia para incrementar el control biológico de nematodos parásitos de plantas. P. chlamydosporia se transformó con la proteína verde fluorescente (GFP) para evaluar la colonización endofítica de raíces de cebada (Maciá Vicente et al., 2009b). Recientemente el genoma de P. chlamydosporia se ha secuenciado y analizado funcionalmente (Larriba et al., 2014). El genoma de P. chlamydosporia muestra una alta similitud con el de los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Metarhizium acridum, lo que indica un posible origen común de ambos grupos de hongos parásitos de invertebrados. El comportamiento endofítico de P. chlamydosporia se justifica también por la similitud de su genoma con el de endófitos, como Epichloë festucae. Por último, en el genoma de P. chlamydosporia se han encontrado un elevado número de familias proteicas que codifican enzimas hidrolíticas, en especial proteasas y glicosidasas, lo que proporciona evidencias adicionales que apoyan el comportamiento multitrófico de este versátil agente de control biológico (Larriba et al., 2014). Las proteasas son un grupo importante de enzimas que el hongo utiliza para parasitar huevos de nematodos (Morton et al., 2003). Las proteasas de P. chlamydosporia son capaces de degradar proteínas de la cubierta de huevos de nematodos tanto formadores de quistes como Globodera pallida (López-Llorca, 1990) y agalladores como Meloidogyne incognita (Segers et al., 1996). La localización de proteasas en apresorios de Pochonia spp. apoya su papel como determinantes de patogenicidad (López-Llorca y Robertson, 1992). Una de las proteasas más estudiadas de P. chlamydosporia es la serín proteasa VCP1, que está muy relacionada filogenéticamente con PR1, una de las principales proteasas de M. anisopliae (Segers et al., 1995; Larriba et al., 2012.). Las quitinasas, otras de las principales enzimas hidrolíticas de Pochonia spp. parece que actúan conjuntamente con proteasas para degradar la cubierta de huevos de nematodos (Tikhonov et al., 2002). Específicamente, la serín proteasa VCP1 y la quitinasa CHI43 de P. chlamydosporia se consideran importantes para el parasitismo de huevos de nematodos (Morton et al., 2003; Tikhonov et al., 2002). Recientemente se ha encontrado una serín carboxipeptidasa, SCP1, en raíces de cebada colonizadas endofíticamente por P. chlamydosporia (López-Llorca et al., 2010). Sin embargo, no se conoce si posee importancia en el parasitismo de huevos de nematodos por P. chlamydosporia. La quitina es un polisacárido compuesto predominantemente por monómeros de N-acetil-D-glucosamina unidos por enlaces glicosídicos ß- (1-4). La quitina es la sustancia nitrogenada más abundante en la naturaleza y el biopolímero más abundante después de la celulosa (Kumar, 2000). La quitina es un componente estructural clave en la cutícula de crustáceos y exoesqueleto de artrópodos (Jeuniaux, 1982). La quitina también está presente en las paredes celulares de los hongos verdaderos (Bartnicki-García, 1968), en algas (Pearlmutter y Lembi, 1978), protozoos (Eichinger, 1997) y en la cubierta de huevos de nematodos (Bird y Bird, 1991). Los residuos de los crustáceos (principalmente marinos) son una fuente abundante de quitina, que genera la contaminación por amonio debido a su alto contenido en nitrógeno (Duarte de Holanda y Netto, 2006; Wang et al., 2011). El quitosano es una forma altamente desacetilada de la quitina. Se encuentra en algunas paredes fúngicas (Zygomycetes), específicamente en el ápice de esporas germinadas (Hadwiger et al., 1981). La quitina es insoluble en agua y en la mayoría de ácidos orgánicos, mientras que el quitosano es soluble en soluciones acuosas ácidas. En dichas condiciones, los grupos amino (-NH2) (pKa~6.3) se convierten en la forma protonada soluble (-NH3+) (Madihally y Matthew, 1999). El quitosano, a diferencia de la quitina, puede actuar como un polímero policatiónico. En ese sentido es una excepción ya que los polisacáridos suelen ser polianiónicos. Desde que Allan y Hadwiger (1979) descubrieron la actividad fungicida del quitosano, varios estudios han demostrado propiedades bactericidas y antifúngicas del quitosano (Liu et al., 2004; Park et al., 2004; Tikhonov et al., 2006). Los hongos fitopatógenos como Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici (Tikhonov et al., 2006), Ustilago maydis (Olicón-Hernández et al., 2015), Gaeumannomyces graminis var. tritici (Palma-Guerrero et al., 2008) y el Oomiceto Phytophtora infestans (Atia et al., 2005) son sensibles a quitosano. La actividad antimicrobiana del quitosano depende de su grado de desacetilación (Je y Kim, 2006). Una explicación podría ser que las moléculas de quitosano cargadas positivamente interactúan electrostáticamente con lípidos cargados negativamente en las membranas plasmáticas, causando grandes alteraciones y el aumento de permeabilidad de la membrana. Sin embargo, la membrana plasmática de los hongos parásitos de invertebrados (como P. chlamydosporia) tiene baja fluidez (bajos niveles de ácidos grasos poliinsaturados), y por lo tanto está protegida de daños por quitosano (Palma-Guerrero et al., 2010). Estos hongos son resistentes a quitosano. Además, el quitosano es capaz de aumentar la esporulación de P. chlamydosporia, y estos conidios mantienen su viabilidad (Palma-Guerrero et al., 2008). Finalmente, en un estudio proteómico se encontró que el quitosano aumentó los niveles de serín proteasas implicadas en el parasitismo de huevos de nematodos por P. chlamydosporia (Palma-Guerrero et al., 2010). En agricultura, tanto la quitina como el quitosano han mostrado capacidad para elicitar defensas de las plantas, así como inhibir el crecimiento de hongos y bacterias fitopatógenos (Chittenden y Singh, 2009; López-Mondejar et al., 2012). El tratamiento de plantas de tomate afectadas por Meloidogyne spp. con quitosano redujo el número de masas de huevos (Khalil y Badawy, 2012). Lee et al. (1999) mostraron que el quitosano puede disminuir la apertura estomática mejorando de esta forma las defensas naturales de la planta, ya que los estomas son aperturas utilizadas por hongos fitpatógenos. Como se ha discutido previamente, los nematodos radiculares son un desafío para cultivos de alto valor como el tomate. Su impacto es cada vez mayor, tanto a causa del cambio global (aumento de la temperatura) como por la falta de recursos para la gestión de nematodos fitopatógenos (prohibición de fumigantes y nematicidas). El paradigma de la revolución verde de ¿matar¿ a los nematodos fitopatógenos está dando lugar a un enfoque integrado en el que se combinan varias estrategias (Collange et al., 2011). De esta manera, las prácticas de saneamiento, manejo de suelos, enmiendas orgánicas, los métodos térmicos, cultivos resistentes o trampa, así como agentes de control biológico, se pueden combinar en estrategias para el Manejo Integrado de Plagas (IPM) y reducir de una forma sostenible las poblaciones de Meloidogyne spp. en el campo. En esta tesis doctoral hemos propuesto el término ¿Rhizomodulation¿, como un nuevo enfoque para una gestión sostenible de Meloidogyne spp. La hipótesis de trabajo es que las interacciones rizosféricas (tomate-Meloidogyne spp.-P. chlamydosporia) pueden ser moduladas utilizando quitosano y tal vez otras moléculas implicadas en la defensa de la planta, que puedan bloquear la comunicación entre los nematodos y las plantas. El principal objetivo de esta tesis doctoral es por tanto analizar el sistema tritrófico: tomate, Meloidogyne javanica y Pochonia chlamydosporia, incluyendo quitosano para promover el crecimiento de la planta y aumentar el parasitismo de huevos de nematodos por parte del hongo. Por otro lado, hemos evaluado la producción de las proteasas VCP1 y SCP1 de P. chlamydosporia durante el parasitismo de huevos de Meloidogyne javanica y el efecto del quitosano en este proceso. Estos objetivos principales se pueden subdividir en los siguientes objetivos específicos: - Cuantificar mediante técnicas de cultivo y moleculares (qPCR) la colonización de raíces de tomate por P. chlamydosporia. - Analizar el patrón de colonización de las raíces de tomate y la infección de huevos de M. javanica utilizando un aislado de P. chlamydosporia marcado con GFP. - Estudiar la rizodeposición en el sistema tri-trófico: tomate, P. chlamydosporia y M. javanica utilizando técnicas metabolómicas. - Evaluar el efecto del quitosano sobre el parasitismo de huevos de M. javanica por P. chlamydosporia. - Detectar mediante técnicas inmunológicas el papel de dos de las principales serín proteasas de P. chlamydosporia (VCP1 y SCP1) en el parasitismo de huevos de M. javanica. - Caracterizar la diversidad y evolución filogenética de las familias de proteasas S8 y S10 de P. chlamydosporia. - Elaborar una estrategia integrada para la gestión de M. javanica combinando quitosano y P. chlamydosporia. Por tanto las conclusiones de esta Tesis Doctoral son: 1. Una sola aplicación inoculativa del hongo nematófagos Pochonia chlamydosporia en plántulas de tomate promovió el crecimiento de plantas y causó la colonización de masas de huevos del nematodo parasito de plantas Meloidogyne javanica. 2. Pochonia chlamydosporia tuvo un patrón irregular de colonizaión rizosférica y esta disminuyó con el tiempo. 3. Mediante microscopía confocal láser y utilizando un aislado de Pochonia chlamydosporia transformado con la GFP observamos detalles de la diferenciación de apresorios en la cubierta de huevos del nematodo Meloidogyne javanica. 4. En el sistema tritrófico formado por Pochonia chlamydosporia, Meloidogyne javanica y el tomate, el nematodo fue el factor que más influyó en la rizodeposición. 5. En los exudados radiculares de tomate se detectaron posibles defensas de las plantas bloqueadas por la presencia de Meloidogyne javanica y se detectó un metabolito relacionado con la presencia de Pochonia chlamydosporia. 6. El quitosano aumentó la diferenciación de apresorios, la actividad proteolítica y el parasitismo de huevos de nematodos por Pochonia chlamydosporia. 7. La serín proteasa VCP1 y la serín carboxypetidasa SCP1 se detectaron en conidios germinados de Pochonia chlamydosporia y en huevos de Meloidogyne javanica parasitados por el hongo. 8. El quitosano aplicado en el sistema de riego redujo la multiplicación de Meloidogyne javanica en plantas de tomate y aumentó el parasitismo de huevos de M. javanica por Pochonia chlamydosporia.