In vitro propagation and ex situ conservation of the Western-Mediterranean endemic species Lapiedra martinezii Lag. (Amaryllidaceae)

Resum

Lapiedra martinezii Lag. (Amaryllidaceae) és un geòfit que creix en comunitats vegetals termòfiles i semiàrides dominades pel margalló, Chamaerops humilis L., i Osyris lanceolata Hochst. & Steud. i en diversos tipus de de màquies mediterrànies i matollars. Tanmateix es troba freqüentment en rocalles, escletxes, esquerdes en indrets pedregosos i penya-segats costaners, des del nivell del mar fins als 650 m.s.n.m. a la Península Ibèrica i el Nord d’Àfrica (Ríos et al., 2013). L. martinezii té un elevat potencial econòmic degut a la seva riquesa en alcaloides amb gran interès per a la indústria química i farmacèutica (Larsen et al., 2010; Ríos et al., 2013). A banda, és una planta amb potencial interès per a la indústria de plantes bulboses ornamentals i també té un cert interès en conservació degut a la relativa baixa abundància que mostra al llarg de la seva àrea de distribució, i a les amenaces que s’han detectat a les seves poblacions (Ríos et al., 2013). 1.2.- Les estratègies de conservació ex-situ: la investigació en fisiologia de llavors i l’ús de tècniques de cultiu in vitro com a eina per a la propagació sostenible i la conservació La germinació té una importància capital al cicle biològic de les espècies vegetals i el seu èxit reproductiu, i es pot considerar l’etapa més vulnerable ja que representa l’entrada de les plantes als ecosistemes (Harper, 1977; Rajjou et al., 2012). Per a moltes espècies, el moment de l’any on la germinació és possible pot ser prou limitat (per exemple, només a la tardor, o la primavera, coincidint amb l’estació humida). No obstant això, l’època favorable per a la germinació d’altres espècies es prou llarga, per exemple, durant tot el període de creixement (Baskin i Baskin, 2001). Les plàntules de la majoria de les espècies vegetals emergeixen tan prompte com les llavors han germinat al sòl. Aleshores, el rellotge biològic de l’emergència de les plàntules està principalment regulat pel trencament de la letargia i la presència dels requeriments adequats per a la germinació de les llavors. Per a algunes altres espècies, un considerable lapse de temps hi existeix entre el moment de l’eixida de la radícula al camp, i l’emergència de la plàntula. Les llavors són la via més important de reproducció i dispersió en plantes (Nikolaeva, 2001). La informació sobre la germinació té, potencialment, un gran valor econòmic, per exemple per a la propagació d’arbres autòctons amb important valor econòmic, mates, lianes, herbes i gespes, per a restauració d’ecosistemes degradats, i planificació per un eficaç control de les males herbes (Baskin i Baskin, 2001). Junt amb açò, el desconeixement de la dormició en llavors d’espècies econòmicament importants causa pèrdues econòmiques (Nikolaeva, 2001). Per tant, la investigació en la biologia de les llavors i, particularment, en les condicions òptimes per al trencament de la dormició i promoure la germinació són objectius essencials per plantes amb importància econòmica. Amés, la informació relativa a la fisiologia de la germinació és necessària per a establir procediments de conservació ex situ apropiats i rutines de treball adequades als bancs de germoplasma, així com la planificació de programes de restauració de la coberta vegetal amb espècies autòctones (Baskin i Baskin, 2001; Walters, 2015). Tenint en compte que tant la propagació vegetativa, com la recol•lecció directa de material vegetal de les poblacions naturals no podria satisfer la demanda de bulbs que podria ser requerida per a propòsits industrials, el coneixement de la fisiologia germinativa i el cultiu mitjançant tècniques biotecnològiques, com ara les tècniques de cultiu in vitro (George i Debergh, 2008) semblen ser la via més adequada per a dur a terme un ús sostenible d’aquest recurs, així com per a previndre la sobreexplotació i extinció de les poblacions naturals, com ha passat en altres espècies d’interès econòmic, a priori no amenaçades. 2.- Objectius El treball ací presentat s’ha dut a terme amb l’objectiu de desenvolupar un mètode apropiat per a la propagació in vitro de germoplasma de L. martinezii (llavors, plàntules, escales de bulbs i bases foliars) que podrien ser emprades per a propòsits industrials així com estudiar el comportament de les llavors front a l’emmagatzematge amb la intenció de preservar-les ex situ als bancs de germoplasma. Tanmateix, els resultats obtinguts podrien ajudar a establir un procediment general per a la producció i conservació de plantes endèmiques i amenaçades de la família de les Amaril•lidàcies a Espanya. Concretament, els objectius específics són: 1.- Estudiar les condicions per al venciment de la dormició i la fisiologia de la germinació de les llavors de L. martinezii. 2.- Establir diferents cultius in vitro partint de material vegetal divers (llavors, bulbs i fulles) i provar diferents vies morfogèniques (organogènesi directa i indirecta) de L. martinezii, així com desenvolupar un protocol de micropropagació adequat per als bulbs de L. martinezii. 3.- Avaluar el comportament de les llavors de L. martinezii front a l’emmagatzematge, amb la intenció de desenvolupar un protocol apropiat per a la seva conservació a llarg termini. CONCLUSIONS. - Les llavors de L. martinezii tenen dormició morfològica ja que els embrions han de créixer dins de la llavor, abans que es produixca l’emergència del coleòptil. - La germinació òptima es produeix a 20ºC amb percentatges de quasi un 100% de germinació final en llum i obscuritat. - Les condicions de llum van influir a la velocitat de germinació, però els percentatges de germinació final van romandre sense diferències significatives. - El pretractament de fred va minvar tots els paràmetres de germinació a totes les temperatures assajades, mentre que el pretractament de calor els va incrementar. - L’aplicació exògena de giberelines no va afectar en cap paràmetre a la germinació a les concentracions d’entre 0-0.75 g/L, mentre que les proporcions de llavors germinades va decréixer a les concentracions majors d’1 i 2 g/L. - L’establiment de cultius in vitro de L. martinezii és una tasca prou difícil per les elevades proporcions de contaminació que s’obté durant el procés d’inici de cultiu, degut a la presència de bactèries endògenes. No obstant això, una mescla d’agents antimicrobians formulada amb 500 mg/L de cefotaxima, 5 mg/L d’ampicilina i 15 mg/L de kanamicina durant tres setmanes va ajudar a mantindré els cultius amb uns nivells de proliferació bacteriana inferiors al 30%. - El medi d’inici de cultiu dissenyat amb Gamborg B5 i suplementat amb 10 g/L de sacarosa, va ser el més apropiat per a l’inici de cultius in vitro tant de plàntules com de bulbs. - Els cultius de plàntules en medi MS, suplementat amb 30 g/L de sacarosa, són una bona alternativa per a desenvolupar un stock de material in vitro, que pot mantenir-se sense subcultivar durant 10 mesos a temperatures de cultiu més baixes (17ºC), sense suspendre el creixement. - La millor resposta morfogenètica a la multiplicació es va obtindre amb el medi sòlid MS suplementat amb 30 g/L de sacarosa, BA=4 i NAA=0.12 mg/L en termes de producció de bulbets (5.77 per explant) i calibre (4.07x6.10 mm), com en l’arrelament (96.18%). Amés, la proliferació d’estructures tipus call va ser relativament baixa (24.84%) en comparació amb altres medis de multiplicació provats. - L’arrelament va ser espontani en tots els medis de multiplicació testats i en una ampla proporció de les rèpliques durant el primer període de subcultiu, amb uns valors variables des de 76.43% fins al 100% (excepcionalment 49.68%). Per tant, no va ser necessari dissenyar una fase específica d’arrelament amb medis específics. - El protocol general d’aclimatació ací provat va tindre un elevat percentatge de plantes supervivents per a ambdós tipus d’explants: plàntules (amb una supervivència del 86% per a les plàntules produïdes in vitro) i bulbs (supervivència del 89% per als clons procedents d’explants de bulbs) una vegada transferides a condicions ambientals exteriors. - Les condicions d’obscuritat a 26ºC van afavorir clarament la inducció de call, el seu creixement i desenvolupament, mentre que el fotoperíode testat amb llum va tindre un efecte marginal en la producció de calls. - L’aplicació de 2,4-D és necessària per a la formació del call, independentment de la citocinina emprada al medi (BAP o KIN). - Proporcions elevades d’auxines front a citocinines (al menys 2 vegades) van ser necessàries per a la inducció del call i per a arribar a una òptima eficiència en la seva inducció, que ocorre de forma completa als dos-tres mesos de cultiu. - Els calls amb un nivell de desenvolupament òptim van mostrar un color groc i quasi tots van ser compactes o lleugerament friables. - Les llavors de L. martinezii poden ser dessecades fins nivells de contingut en humitat del 4.10%, i emmagatzemades a -20º, -80ºC o mitjançant immersió en nitrogen líquid, sense cap efecte significatiu en la germinació. - Pel que fa al comportament de les llavors de L. martinezii front a l’emmagatzematge, les dades ací obtingudes demostren que són ortodoxes.