Mecanismos de modulación de receptores nicotínicos por anestésicos locales con grupos amino

Resumen

La tetracaína (Ttc), cuyas moléculas en solución fisiológica se encuentran mayoritariamente (97 %) en forma protonada, bloquea la corriente (IACh) evocada por acetilcolina (ACh) en ovocitos a los que se ha microtrasplantado receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) de la electroplaca de Torpedo marmorata. El bloqueo del nAChRm por Ttc fue muy potente, en el rango submicromolar (IC50= 0.5 M) y reversible, recuperándose las respuestas a valores control tras un periodo de varios minutos. A concentraciones tan bajas como 0.1 M, la Ttc ejerció un bloqueo que fue dependiente de voltaje, indicando que ejerce un bloqueo a canal abierto. El sitio de unión se pudo determinar en el interior del canal mediante técnicas de acoplamiento molecular. A concentraciones mayores (0.7 M) se pudo observar un mecanismo de bloqueo distinto, a canal cerrado, que es independiente de voltaje y que se puede explicar por la unión de la Ttc a lugares situados en el ECD del nAChRm, que fueron determinados en los experimentos de docking virtual. Además, a esta concentración la Ttc aceleró la cinética de desensibilización de la IACh, cuando las células se mantuvieron en presencia sostenida del agonista. Esta se evocó cuando se co-aplicó la Ttc junto a la ACh a potenciales negativos. Por el contrario, cuando solamente se pre-aplicó la Ttc (aplicación previa a la de ACh), o cuando se co-aplicó a potenciales positivos, no se modificó la cinética de desensibilización, a pesar de que sí hubo una cierta inhibición de la IACh. Estos experimentos permitieron determinar que el sitio de unión de la Ttc que acelera la desensibilización se encuentra en el interior del canal. El ensayo de docking permitió localizar los residuos a los que su une la Ttc dentro del canal a altas concentraciones (con menor afinidad), que es más superficial que el implicado en el bloqueo a canal abierto. El lugar de unión determinado por anclaje virtual incluye la interacción de Ttc con αE262, γN224, γK271, y γE274, residuos que han sido previamente involucrados en el proceso de activación y desensibilización (Bouzat y cols., 2008; Forman y cols., 2007). El otro anestésico local (LA) estudiado, la benzocaína (Bzc), no posee carga al pH al que se efectúan los registros electrofisiológicos. La Bzc, al igual que la Ttc, inhibió la IACh, pero con una potencia menor, en el rango submilimolar y, a diferencia de la Ttc, su bloqueo fue independiente de voltaje. A pesar de mediar un bloqueo independiente de voltaje, la Bzc, evoca una corriente de rebote (IRb), similar a la que median moléculas que ejercen un bloqueo de canal abierto, sugiriendo que la Bzc podría estar uniéndose en el interior del canal. Otro efecto destacado de la Bzc sobre el nAChRms fue la aceleración de la desensibilización, haciéndola marcadamente más rápida incluso a potenciales positivos (a diferencia del efecto mediado por la Ttc). Además, se observó que, tras su pre-aplicación, la cinética de activación de la IACh se enlenteció y hubo un bloqueo de nAChRs, a canal cerrado, cuya recuperación fue especialmente lenta. Los efectos de ambos LAs fueron muy diferentes sobre los GABAAR. Así, la Ttc apenas tuvo efectos sobre este receptor, incluso a una concentración 10 veces superior a la IC50 determinada para el nAChRm. Por el contrario, la Bzc, aplicada a concentraciones similares a las que inhiben la IACh, aumentó la desensibilización y evocó una IRb similar a la observada en los nAChRs. Adicionalmente, la Bzc tuvo efectos sobre otros canales, como el ClC-0 y el CaCC. En relación con la Bzc, es interesante destacar que debido a su estructura química tiene una muy baja solubilidad al agua y, por tanto, debe solubilizarse en solventes como el etanol (EtOH) o el DMSO. Debido a que estos solventes pueden no ser totalmente inertes se probaron, en las mismas condiciones experimentales. No observándose efectos sobre los nAChRms.