Enzymatic bioelectrocatalysis on well-defined electrode surfaces

Laburpena

La principal motivación de esta tesis es caracterizar desde un punto de vista fundamental el comportamiento electroquímico y espectroscópico tanto de moléculas biológicas sencillas como son los neurotransmisores (dopamina) o las quinonas (4-metilcatecol, 4-etilcatecol y catecol) como de moléculas biológicas complejas como son las enzimas redox denominadas lacasas (CueO). Mientras que los neurotransmisores o las quinonas en seres humanos y animales, están implicados en los procesos de transmisión de impulsos nerviosos, las enzimas redox actuán como catalizadores de un gran número de procesos biológicos basados en reacciones de transferencia de electrones que permiten obtener la energía necesaria para muchos sistemas de vida, como la reducción de oxígeno (O2) a agua (H2O) durante la respiración, la oxidación de azúcares a CO2 u otras vías metabólicas como la glicólisis o la fosforilación oxidativa. El grupo de electroquímica en el que se ha desarrollado la tesis posee una amplia experiencia en el estudio de procesos de electrosorción de moléculas relativamente sencillas sobre superficies bien definidas de metales nobles. En esta tesis se ha extendido este tipo de estudios a biomoléculas más complejas, y para ello se ha mantenido la misma metodología basada en un control estricto de las condiciones de estructura y composición superficial del electrodo. Para la realización de este trabajo se han usado técnicas electroquímicas tales como voltametría cíclica, electrodo rotatorio y desplazamiento de carga. También se han usado técnicas espectroscópicas como la espectroscopia infrarroja o la espectroscopía ultravioleta-visible y Raman. Finalmente, se han realizado estudios empleando la microscopía de efecto túnel para completar la información. En esta tesis perteneciente al campo de la bioelectrocatálisis y las biopilas de combustible se describen los distintos procedimientos utilizados para la funcionalización de electrodos y la inmovilización de enzimas. Así mismo, se resumen las propiedades de las catecolaminas y las multicrobre oxidasas, así como sus estructuras, reacciones, mecanismos de transferencia electrónica y métodos de síntesis. En la primera parte de este trabajo se ha descrito la reactividad de las catecolaminas sobre electrodos de oro, platino, carbón vítreo y carbón tipo diamante, prestando especial atención a los procesos de adsorción y oxidación registrados a bajos y altos potenciales, respectivamente. Así mismo los experimentos espectroelectroquímicos han permitido caracterizar el comportamiento de las catecolaminas adsorbidas y en disolución. En la segunda parte se ha investigado la influencia del sustrato electródico empleado para la inmovilización de la proteína sobre la catálisis de la reacción de reducción de O2. Con este propósito la proteína se ha inmovilizado sobre electrodos de carbón vítreo, oro y platino sin modificar y modificados con diferentes monocapas autoensambladas que interactúan con la proteína en función de la carga alrededor del centro activo de la proteína y de la naturaleza del grupo funcional de la monocapa autoensamblada empleada. Así mismo en esta parte se han estudiado las condiciones óptimas (tiempos de inmovilización, potenciales, pH, temperatura, concentración de proteína y de O2) para la catálisis de la reacción de reducción de O2 por parte de la CueO y su comportamiento electroquímico y espectroscópico. Finalmente en la última parte de la tesis se ha estudiado el efecto sobre la catálisis de la reacción de reducción de O2 de compuestos comúnmente descritos en la literatura como inhibidores, tales como fluoruros (F-), cloruros (Cl-) o azidas (N3-). Además, en presencia de estos compuestos inhibidores y empleando para ello las espectroscopías ultravioleta-visible y Raman se ha determinado el mecanismo de transferencia electrónica desde el electrodo hasta el centro activo de la proteína donde el O2 es reducido a H2O. A partir de los resultados descritos en la primera parte de esta tesis se ha concluido que: - La dopamina se adsorbe irreversiblemente sobre el platino. La desorción de la dopamina de la superficie se consigue al ser sometida a potenciales próximos a la evolución de hidrógeno. - El grado de bloqueo superficial por parte de la dopamina depende de la orientación del monocristal empleado. - Los picos voltamétricos a bajos potenciales corresponden a la desorción competitiva de los procesos de adsorción de hidrógeno y dopamina. El aumento del potencial provoca la reorientación de las moléculas de dopamina y tiene como resultado una adsorción más fuerte de la molécula sobre la superficie. Un aumento adicional del potencial produce la oxidación de la dopamina a través de un mecanismo ECE o ECC que conlleva la formación de una gran variedad de compuestos derivados de la dopamina. - Los resultados obtenidos mediante espectroscopía infrarroja confirman tanto la transformación de los grupos C-OH en grupos C=O debido a los procesos de oxidación o reducción a potenciales altos; como la adsorción de la molécula plana sobre la superficie del electrodo a bajos potenciales. - El catecol, el 4-metilcatecol y la dopamina presentan comportamientos electroquímicos cuasi-reversibles sobre electrodos de carbón tetraédrico amorfos (ta-C), con cinética de transferencia de electrones lenta. Las reacciones están aparentemente controladas por difusión. - El deterioro de la respuesta del ta-C a pH neutro y alcalino es mayor que a pH ácido, debido a la existencia de reacciones homogéneas acopladas después de la oxidación de las moléculas a sus correspondiente ortoquinonas. - La oxidación de la dopamina sobre electrodos de carbón vítreo y tipo diamante (ta-C) sigue un mecanismo EC y la formación de polidopamina pasiva la superficie de los electrodos. - La cinética de transferencia de electrones es más rápida para el carbón vítreo que para el ta-C, y además el carbón vítreo es menos susceptible al envenenamiento superficial. - El oro es el electrodo más activo para la oxidación del catecol, 4-metilcatecol y la dopamina. Es también el electrodo que sufre menos envenenamiento superficial tras el proceso de ciclado en presencia de estos compuestos. - El comportamiento electroquímico de catecol, 4-metilcatecol y dopamina sobre sustratos de oro muestra una mayor "reversibilidad" para el proceso redox que sobre electrodos de platino o el ta-C. - El aumento del pH incrementa los procesos de hidroxilación y polimerización del catecol y el 4-metilcatecol dificultando así la transferencia electrónica en términos de potencial y corriente. - Los datos espectroscópicos permiten identificar tanto las especies adsorbidas como en disolución cerca de la superficie del electrodo de platino para cada molécula. Experimentos espectroscópicos adicionales realizados con películas de oro también demuestran la existencia de capas de adsorción de dopamina o derivados de dopamina sobre la superficie del electrodo. - Los resultados de microscopía de efecto túnel en presencia de dopamina demuestran la formación de puntos brillantes (que se hacen más grandes a medida que aumenta el número de ciclos) distribuidos aleatoriamente sobre la superficie del electrodo de oro corroborando la existencia de dopamina o moléculas derivadas adsorbidas sobre ella. A partir de los resultados obtenidos en la segunda parte de la tesis se ha concluido que: - La proteína CueO inmovilizada sobre carbón vítreo, oro o platino no modificado o modificado con diferentes monocapas autoensambladas, preserva su actividad catalítica para la reducción de O2 a H2O y exhibe transferencia electrónica directa (DET) entre el electrodo y la enzima. - Las condiciones experimentales óptimas de trabajo para la catálisis de la reacción de reducción de O2 a H2O por parte de la CueO son el uso de tiempos de inmovilización entre 1-40 min, el uso de bajas concentraciones de proteínas expuestas a pH neutro, bajos potenciales, altas temperaturas y altas concentraciones de O2. Además, los resultados demuestran claramente que F- y N3- inhiben la catálisis de la reducción de O2 a H2O, pero la proteína retiene su actividad catalítica en presencia de Cl-. Así mismo, los datos reflejan que el proceso de inhibición de la catálisis de la reducción de O2 a H2O por parte de la CueO es totalmente reversible en el caso de F- y parcialmente reversible en el caso de N3-. - La voltametría cíclica, la espectroscopía Raman y la microscopía de efecto túnel son técnicas útiles para investigar la actividad catalítica de la enzima CueO inmovilizada sobre sustratos de oro. - La mayor actividad catalítica de CueO se registra para la proteína inmovilizada sobre electrodos de oro modificados con grupos terminales NH2. - Los experimentos de microscopía de efecto túnel empleando electrodos de oro modificados con 4-aminotiofenol, cisteamina y ácido mercaptopropiónico demuestran que el oxígeno induce cambios importantes en la estructura electrónica y conformacional de la proteína, mejorando el túneleo de electrones entre el ensamblaje eletrodo-CueO-electrodo. - Los sitios de reacción de CueO son electrónicamente inertes bajo condiciones anaeróbicas en argón, mientras que los sitios de reacción de CueO son altamente activos (para el túnel) en presencia de oxígeno. - Las bandas Raman a 385 cm-1 y 414 cm-1 se identifican con la vibración Cu-S (Cys) en el centro de cobre tipo 1. - Los cambios en el estado de oxidación del centro de cobre tipo 1 durante el ciclo catalítico de la enzima inmovilizada en ausencia, así como en presencia de oxígeno, se detectan en base a la intensidad de la banda Raman. - El desplazamiento del potencial hacia valores negativos conlleva a la reducción del cobre tipo 1 de Cu (II) a Cu (I), mostrando claramente la existencia de DET entre la enzima y el electrodo. - UV-Vis y Raman son técnicas apropiadas para realizar experimentos in situ para CueO en disolución. Ambas técnicas permiten la detección de señales del cobre de tipo 1 (II) a partir muestras de proteína en disolución en ausencia y en presencia de inhibidores. - Los experimentos UV-Vis y Raman proporcionan nueva información sobre las vías de transferencia de electrones desde el mediador / disolución al sitio activo donde el O2 es reducido a H2O. - F- y N3- bloquean las vías de transferencia de electrones de una manera diferente dependiendo del inhibidor; el F- evita la transferencia de electrones desde el cobre tipo 1 al cluster de cobre tipo 2/3 (donde tiene lugar la reducción de O2 a H2O) sin modificar la dependencia con el potencial del sitio de cobre tipo 1. En cambio las N3- inhiben la actividad enzimática bloqueando el acceso de electrones al sitio tipo 1 desde el mediador en disolución.