GlnK regulatory proteins and their role in Haloferax mediterranei nitrogen metabolism

Resumo

Los resultados de esta investigación se resumen a continuación: 1. Los genes glnK y amt en Haloferax mediterranei Hfx. mediterranei presenta dos genes codificantes para proteínas PII (glnK1 y glnK2), ambos ligados a transportadores de amonio (Pedro-Roig y col. 2011). Las secuencias de amino ácidos de ambas proteínas son 84 % idénticas y sus propiedades físico-químicas teóricas muy similares debido a ello. Hfx. mediterranei presenta también dos genes codificantes para transportadores de amonio (amt1 y amt2); las secuencias de amino ácidos de sus productos génicos son 52 % idénticos aunque Amt1 presenta una extensión C-terminal. 2. Construcción de cepas mutantes de Haloferax mediterranei Las cepas mutantes de los microorganismos son una herramienta muy útil para la identificación de la función de genes desconocidos, el estudio de la relación estructura-función de proteínas o la identificación de elementos involucrados en la expresión génica. La construcción de mutantes en las haloarqueas se fundamenta en el método pop-in pop-out, que aprovecha el sistema natural de recombinación homóloga de la célula. Varios marcadores genéticos han sido desarrollados con este propósito, entre los cuales destacan los genes para la síntesis de novo de pirimidinas. Cuando este trabajo empezó, no existía ninguna referencia a la construcción de mutantes en Hfx. mediterranei; sin embargo, además del sistema descrito en este trabajo y basado en el gen pyrE2, una segunda estrategia utilizando el gen pyrF ha sido desarrollada recientemente (Liu y col. 2011). La creación de una cepa ¿pyrE2 en Hfx. mediterranei y su aplicación a la obtención de mutantes knockout y knockin se detalla a continuación. Optimización de las condiciones de transformación de Hfx. mediterranei La transformación de esferoplastos de haloarquea utilizando PEG fue descrita por primera vez por Cline y colaboradores en 1987 (Cline y col. 1987). Los esferoplastos se obtienen quelando los cationes magnesio que estabilizan las membranas de las haloarqueas; posteriormente se añade PEG para mediar la introducción del DNA foráneo en la célula. Los esferoplastos se regeneran por incubación en medio con niveles normales de magnesio y suplementado con sacarosa. Este método ha sido aplicado con éxito a Hbt. salinarum y Hfx. volcanii (Cline y col. 1989), pero en nuestra experiencia, dicho protocolo no es eficiente en Hfx. mediterranei. Para mejorar la eficiencia de transformación, algunos de los parámetros de la misma se modificaron, aunque el aumento de la concentración de EDTA resulto ser el factor clave. Las condiciones de transformación optimizadas para Hfx. mediterranei son 1,5 M NaCl en la solución de esferoplastos, 75 mM EDTA para la formación de los esferoplastos, 25 % (p/v) PEG y cultivos de OD (600 nm) de entre 0,2 y 0,5 unidades. Método pop-in pop-out para la construcción de mutantes de deleción en Hfx. mediterranei La construcción de mutantes de deleción en Hfx. volcanii se realiza rutinariamente utilizando el método pop-in pop-out y la cepa H26 (¿pyrE2), que aprovecha los sistemas de selección positiva y contra-selección que aporta dicho gen al estar involucrado en la síntesis de novo de pirimidinas (Bitan-Banin y col. 2003). Para poder aplicar este método a Hfx. mediterranei, se creó una cepa equivalente a H26. El sistema pop-in pop-out para la deleción de genes se basa en la sustitución de una determinada secuencia en el genoma por otra modificada in vitro. La sustitución se consigue por recombinación homóloga entre el DNA genómico de la célula y un plásmido que contiene la versión delecionada del gen de interés. Dicho plásmido contiene una copia del gen pyrE2 y debe ser incapaz de replicarse de forma autónoma en el organismo a ser modificado (vector suicida). Una cepa ¿pyrE2 de dicho organismo se transforma con el plásmido y al recombinar éste con el cromosoma, se genera una cepa en cuyo genoma se encuentra la versión original más la versión delecionada del gen (pop-in). Los pop-ins pueden ser seleccionados en un medio carente de uracilo, dado que solo las células que codifiquen el gen pyrE2 (presente en el plásmidos suicida) podrán sintetizar de novo dicho compuesto y crecer. A continuación, el plásmido suicida se pierde por un segundo evento de recombinación homóloga y junto con él una de las copias del gen, delecionada u original (pop-out). Esta segunda recombinación homóloga es inducida por la presencia en el medio de un compuesto que es tóxico únicamente para las células que codifican el gen pyrE2: ácido 5-fluoroorotico (5-FOA). Esto se debe a que este análogo del orotato es metabolizado generando un compuesto que bloquea el crecimiento. El método pop-in pop-out para la creación de mutantes de deleción se basa en la recombinación homóloga entre un determinado gen en el cromosoma y una versión delecionada del mismo contenida en un plásmido suicida. El gen debe ser eliminado de forma controlada: la mayor parte del mismo desaparece, pero una parte se mantiene de manera que un pequeño péptido no funcional pueda aún ser transcrito (mutantes de deleción en marco). Esto se consigue clonando las regiones aguas arriba y abajo que flanquean el gen a ser delecionado, manteniendo únicamente unas pocas bases del propio gen. Para crear la cepa HM26 (equivalente a Hfx. volcanii H26, ¿pyrE2), el gen pyrE2 de la cepa salvaje de Hfx. mediterranei fue sustituido por una versión delecionada del mismo. Hfx. mediterranei R4 fue transformada con el plásmido suicida pMH101N-¿pyrE2, portador del gen gyrB de resistencia a novobiocina, y los transformantes fueron seleccionados en placa en presencia del antibiótico. Dado que este plásmido no puede ser replicado autónomamente al carecer de origen de replicación en haloarqueas, las células que hayan introducido el plásmido en el cromosoma por recombinación homóloga (pop-in) son directamente seleccionadas. La integración del plásmido puede tener lugar por recombinación homóloga en 5¿ o 3¿ del gen a ser delecionado, lo que resulta en dos organizaciones genómicas distintas para el pop-in. Las células se crecieron a continuación en medio mínimo suplementado con novobiocina para asegurar que el plásmido estuviese presente en todas las copias del genoma de la célula, dado que las haloarqueas son poliploides (Breuert y col. 2006; Lange y col. 2011). Después de ello, las células se sembraron en medio suplementado con uracilo y 5-FOA de manera que sólo aquellas que hubiesen perdido el gen pyrE2 pudiesen crecer (pop-out). Las colonias resistentes a 5-FOA fueron crecidas durante varias generaciones en presencia del tóxico y sus genomas fueron analizados por Southern blot asegurando de este modo que el gen pyrE2 había sido eliminado correctamente. A continuación, el fenotipo del pop-out (cepa HM26, ¿pyrE2) fue: dicha cepa es incapaz de crecer en medio mínimo a menos que sea suplementado con uracilo pero resiste concentraciones de 5-FOA letales para la cepa salvaje (R4), al igual que H26 (¿pyrE2 en Hfx. volcanii). Además, el crecimiento en medio suplementado con uracilo no se diferencia del de la cepa salvaje. Se puede concluir, pues, que la deleción del gen pyrE2 se llevó a cabo de forma correcta y que el fenotipo de HM26 permite su aplicación como cepa parental para la construcción de otros mutantes en Hfx. mediterranei. Construcción de mutantes knockout en Hfx. mediterranei: deleción de los genes glnK La cepa HM26 (¿pyrE2) y el método pop-in pop-out fue utilizado de forma satisfactoria para eliminar los genes glnK del genoma de Hfx. mediterranei. Se construyeron dos plásmidos suicida portando cada uno de ellos el cassette de deleción para uno de los genes glnK, y a continuación se utilizaron para construir mutantes simples de estos genes usando HM26 como cepa parental. Finalmente se obtuvo el doble mutante, carente de ambos genes, glnK1 y glnK2, utilizando la cepa ¿glnK1 como parental. Se comprobó por Southern blot el genoma de los tres knockout y los resultados mostraron que los genes habían sido eliminados correctamente en todos los casos. Construcción de mutantes knockin en Hfx. mediterranei: introducción de un Flag-Tag en los genes amt En la sección previa, el método pop-in pop-out se utilizó con el objetivo de delecionar un gen en particular; en esta, el mismo procedimiento se aplica para introducir un fragmento extra de DNA en el genoma de forma también controlada. En este caso, se construye in vitro un plásmido suicida que contiene un variante del gen pero, en vez de tratarse de una versión truncada del mismo, se le añade una secuencia adicional. Como primer paso se amplificó un fragmento de 1 kb que contenía 500 pb a cada lado del locus en el que se pretendía introducir la secuencia extra y a continuación se introdujo dicha secuencia como parte de los oligonucleótidos en una PCR Inversa. El resto del procedimiento coincide con la construcción de mutantes knockout: se transformó HM26 (¿pyrE2) con el plásmido suicida portador de una copia del gen pyrE2 y la secuencia alterada, se seleccionaron en ausencia de uracilo las células cuyo cromosoma hubiese integrado por recombinación homóloga dicho plásmido y finalmente se forzó la pérdida del plásmido sembrando los pop-in en presencia de uracilo y 5-FOA. Un pop-out que retuvo la versión del gen marcada con el Flag-Tag fue seleccionado y su DNA genómico sometido a Southern blot para verificar la correcta incorporación de la secuencia extra. El objetivo concreto de la construcción de estos mutantes fue la introducción de una cola Flag en las copias de los genes amt del cromosoma de Hfx. mediterranei. Estas cepas eran de interés para su aplicación en la identificación de la interacción GlnK-Amt en Hfx. mediterranei mediante estudios de inmunoprecipitación. Se construyeron y comprobaron por Southern Blot 4 cepas distintas: marcaje de amt1 y amt2 tanto en sus extremos N- como C-terminal. 3. Expresión de las proteínas GlnK y análisis de las cepas ¿glnK La transcripción de la región genómica amt-glnK fue analizada por Northern blot para identificar las unidades transcripcionales y las condiciones bajo las cuales dichos genes son activos. Muestras de RNA aislado de la cepa salvaje de Hfx. mediterranei se hibridaron con 4 sondas distintas, todas ellas marcadas con digoxigenina, y cuyas secuencias correspondían a cada uno de los 4 genes de interés: amt1, glnK1, amt2 y glnK2. Se obtuvieron señales correspondientes a un mRNA de 2000 ribonucleótidos en las muestras aisladas de células crecidas en nitrato con cualquiera de las cuatro sondas, mientras que en las muestras de amonio y extracto de levadura ningún fragmento hibridó. Las señales fueron intensas para las sondas amt1 y glnK1 pero débiles para amt2 y glnK2. Estos resultados sugieren que los genes de interés se cotranscriben en pares: amt1glnK1 y amt2glnK2. El patrón de expresión de GlnK a nivel de proteína concuerda con el análisis transcripcional: se realizó un inmunoblot utilizando anticuerpos específicos para GlnK de Hfx. mediterranei, de las muestras de proteína total de células crecidas en nitrato, amonio y extracto de levadura, y los resultados mostraron que GlnK está presente solo durante crecimiento en nitrato. Además, se detectó una única banda, probablemente correspondiente a GlnK1 ya que sus niveles de transcripción son mucho mayores y ambos homólogos pueden diferenciarse por su movilidad electroforética en las condiciones del ensayo (15 % SDS-PAGE). Para la caracterización fenotípica de los mutantes ¿glnK el crecimiento de las cepas HM26-K1 (¿glnK1), HM26-K2 (¿glnK2) and HM26-K1K2 (¿glnK1 ¿glnK2) se comparó con el de la cepa parental (HM26, ¿pyrE2). En medio complejo (extracto de levadura) y en presencia de amonio (0,5 % (p/v) glucosa y 5 ó 75 mM NH4Cl), no se observó ninguna diferencia en el crecimiento de las mismas; sin embargo, las cepas HM26-K1 (¿glnK1) y HM26-K1K2 (¿glnK1 ¿glnK2) crecieron hasta densidades ópticas menores cuando KNO3 se añadió como fuente de nitrógeno (0,5 % (p/v) glucosa y 5 ó 75 mM KNO3). Estos fenotipos concuerdan con el análisis de la expresión a nivel de mRNA y proteína, e indican que GlnK1 es necesaria durante el crecimiento en nitrato mientras que la célula no requiere de la acción de dichos reguladores durante el crecimiento con amonio o en medio comlejo. Las proteínas PII se ocupan del control transcripcional de los genes regulados por nitrógeno mediante interacción con otras proteínas, por ejemplo, el sistema de transducción de señales de dos componentes NtrBC en E. coli es capaz de activar la transcripción del gen codificante de la glutamina sintetasa (glnA) en respuesta a las señales de GlnB (Leigh y Dodsworth 2007). Para determinar si la transcripción de los genes glnK está regulada por su propio producto génico, se utilizaron las cepas ¿glnK. Aprovechando la cotranscripción de amt y glnK, la presencia del mRNA codificante para glnK se pudo identificar en cepas carentes de dichos genes amplificando un fragmento correspondiente a los genes amt1 o amt2. De los resultados previos, los operones amtglnK se transcriben cuando la fuente de nitrógeno es nitrato pero son inactivos en presencia de amonio. Para comprobar si este patrón se conserva en células carentes de genes glnK o si, al contrario, la ausencia de los mismos supone una alteración en su propia transcripción, ensayos de RT-PCR fueron llevados a cabo utilizando muestras de RNA de las cepas HM26 (¿pyrE2), HM26-K1 (¿glnK1), HM26-K2 (¿glnK2) y HM26-K1K2 (¿glnK1 ¿glnK2). Se analizaron dos medios distintos: medios mínimos con 0,5 % (p/v) de glucosa y 75 mM de KNO3 o NH4Cl, suplementados con uracilo. Las células se cosecharon para aislar RNA a mitad de la fase exponencial. Los resultados de RT-PCR de la cepa parental (HM26) fueron consistentes con los del Northern blot de la cepa salvaje (R4): se detectó expresión de ambos operones amtglnK en células crecidas con nitrato pero no en células crecidas con amonio. Además, la conservación del patrón de bandas en las cepas HM26-K1 (¿glnK1), HM26-K2 (¿glnK2), y especialmente en la cepa HM26-K1K2 (¿glnK1 ¿glnK2), indicó que GlnK no regula la transcripción de los operones amtglnK. 4. Modificación post-traduccional de las proteínas GlnK de Haloferax mediterranei Los procesos celulares están regulados no solo por la abundancia relativa de las proteínas en la célula, sino también por alteraciones temporales de su actividad o por asociación y localización de las mismas y sus complejos. Dichas propiedades vienen determinadas no tanto por los niveles de expresión como por modificaciones post-traduccionales (PTM) (Jensen 2000). Se ha descrito en diferentes organismos que las proteínas PII están sujetas a modificación post-traduccional, pero no existe ningún trabajo de este tipo hecho en un organismo halófilo. En cuanto al Dominio Archaea, no se han encontrado modificaciones post-traduccionales de PII por el momento (Leigh y Dodsworth 2007). Como ejemplo, la proteína GlnK1 del euryarchaeota Methanosarcina mazei no se modifica como respuesta a una limitación de nitrógeno (Ehlers y col. 2002). Para identificar posibles PTMs en las GlnK de Hfx. mediterranei se utilizó una aproximación proteómica: el proteoma completo de la célula se separó por electroforesis bidimensional (2-DE) y fue sometido a Western blot con anticuerpos específicos para GlnK. Los spots reactivos se analizaron por espectrometría de masas (MS). Resolución de las proteínas GlnK en 2-DE utilizando tiras de rango estrecho de pI El proteoma completo de Hfx. mediterranei cepa R4 se sometió a electroforesis bidimensional utilizando tiras IPG de rango estrecho (pH 4.7-5.9, Bio-Rad) y geles en gradiente (Any kD TGX, Bio-Rad). Una tinción Coomassie del gel de este tipo con una muestra de células crecidas en 75 mM KNO3 revela acumulación de proteínas en el extremo ácido de la tira (pH 4,7): la mayoría de las proteínas se concentran en esta zona dado que su pI es 4,7 ó menor, característica típica de los proteomas halófilos (Karadzic & Maupin-Furlow 2005). Dicha acumulación a pI menores de 5 no supone un problema para estos ensayos dado que las proteínas GlnK presentan pI alrededor de 5,1 y por tanto su resolución no se ve dificultada. Un Western blot de la muestra anterior con anticuerpos específicos para GlnK reveló dos spots bien resueltos con reactividad por el mismo. Patrón de expresión de GlnK en 2-DE El objetivo de estos experimentos fue determinar los niveles de expresión de GlnK e identificar la existencia de posibles modificaciones post-traduccionales en dichas proteínas. Se utilizaron varios medios con distintas fuentes de nitrógeno, tanto ricas como pobres, dado que en otros organismos el estado de modificación covalente de las proteínas PII depende de la disponibilidad de nitrógeno. Por ejemplo, en E. coli la uridililación de GlnB está inducida por un déficit de nitrógeno mientras que las mismas se desuridililan siguiendo un pulso de amonio (Leigh y Dodsworth 2007). Primero, para asegurar la expresión de GlnK, las células se crecieron en 75 mM de nitrato hasta una OD de 1,9 y se tomó la muestra inicial. Para analizar la respuesta de los niveles de expresión y estado de modificación covalente en función de la disponibilidad de nitrógeno, las células crecidas en nitrato fueron cosechadas, lavadas con agua de sales y transferidas a nuevos medios conteniendo las siguientes fuentes de nitrógeno: 100 mM NH4Cl, 5 mM NH4Cl y hambre de nitrógeno (ausencia de fuente de nitrógeno). En todos los casos, los medios mínimos fueron suplementados con 0,5 % (p/v) glucosa como fuente de carbono. Se tomaron muestras después de 20 horas a partir del cambio medio y las mismas se sometieron a 2-DE, con las condiciones descritas previamente, e inmunoblot con anticuerpos específicos para GlnK. Dos spots mostraron reactividad en la muestra de células crecidas con nitato; cuando las mismas fueron transferidas a un medio con 100 mM de amonio, las señales decrecieron, mientras que se conservaron del mismo orden en la muestra de 5 mM de amonio. La respuesta más interesante, sin embargo, fue la obtenida al someter las células a hambre de nitrógeno: la expresión se incrementó fuertemente en comparación a cualquier otra situación. De estos resultados, se puede derivar un papel relacionado con la activación de la asimilación de nitrógeno para las proteínas GlnK, dado que su expresión es elevada en condiciones de deficiencia de nitrógeno (hambre de nitrógeno o fuentes de nitrógeno energéticamente pobres como nitrato), mientras que su expresión disminuye drásticamente en medios ricos en nitrógeno (amonio en alta concentración). Además de las diferencias en los niveles de expresión de GlnK existentes entre los distintos medios analizados, es relevante destacar que no solo uno, sino varios spots de peso molecular alrededor de 12 kDa (peso molecular de las proteínas GlnK) presentaron reactividad con el anticuerpo. Los blots mostraron fondos limpios, sin unión inespecífica del anticuerpo, por tanto, las distintas señales a 12 kDa (cuyo peso molecular y pI es muy similar a los valores teóricos para las proteínas GlnK) deben corresponder a distintas formas de las mismas. En la sección siguiente se considera si dichas señales corresponden a ambos homólogos de GlnK (GlnK1 y GlnK2) o bien únicamente a uno de ellos en diferentes estados de modificación post-traduccional. Posición teórica de los spots de GlnK en una 2-DE El inmunoblot de la muestra sometida a hambre de nitrógeno muestra 5 señales distintas; para identificar a qué polipéptido corresponde cada una de ellas, se llevaron a cabo algunos análisis y predicciones teóricas. A partir de células de E. coli se obtuvieron GlnK recombinantes como proteínas de fusión con una cola de histidina. Una mezcla de dichas proteínas puras se sometió a electroforesis bidimensional e inmunoblot con anticuerpos específicos para GlnK y se observaron dos señales correspondientes a spots de igual pI pero movilidades electroforéticas en la segunda dimensión ligeramente distintas. Una comparación con un gel SDS-PAGE monodimensional en el que ambas proteínas fueron separadas en calles diferentes permite relacionar el spot superior, de menor movilidad electroforética (peso molecular aparente superior) como His6-GlnK2 y el spot inferior como His6-GlnK1. Es recalcable que la variación de peso molecular entre ambas GlnKs sea solo de 0,2 kDa, y a pesar de ello puedan diferenciarse claramente en una electroforesis. Por otra parte, los spots aparecen a pIs mucho mayores que las proteínas nativas carentes de cola de histidina, como consecuencia de la naturaleza básica de los amino ácidos añadidos. Por tanto, del blot de las proteínas puras se puede deducir que los diferentes homólogos de GlnK en un mismo estado de modificación aparecen en una 2-DE como spots de distinto peso molecular pero mismo pI (patrón vertical). Por otra parte, la mayoría de estos blots muestran situaciones en las que varios spots con el mismo peso molecular pero distinto pI son reactivos con el anticuerpo. El punto isoeléctrico es una propiedad inherente de las proteínas que se encuentra registrado en las bases de datos; además, las predicciones teóricas se acercan mucho a los valores experimentales obtenidos por isoelectroenfoque (IEF), siendo esto muy útil para la identificación de proteínas (Zhu y col. 2005). A pesar de ello, en algunos casos se observa una variación en el pI con respecto al valor teórico, lo que frecuentemente se relaciona con la existencia de modificaciones post-traduccionales (PTMs). De hecho, esta diferencia suele ser significativa del número y tipo de modificaciones presentes (Zhu y col. 2005). Por tanto, un patrón horizontal de spots (mismo peso molecular pero distinto pI) representa diferentes formas modificadas de una miso homólogo de GlnK. Es por ello que parece poco probable que las proteínas GlnK de Hfx. mediterranei no sean sometidas a modificación covalente como se pensaba para el Dominio Archaea (Ehlers y col. 2002; Leigh y Dodsworth 2007) siguiendo el ejemplo de Bacillus subtilis y plantas (Wray y col. 1994; Moorhead y col. 2007). Análisis por espectrometría de masas La espectrometría de masas (MS) es una técnica utilizada rutinariamente en proteómica para la identificación de proteínas. Para ello, la proteína problema se digiere con tripsina y se realizan mediciones muy precisas de la masa de los péptidos resultantes utilizando un espectrómetro de masas. Los resultados se comparan finalmente con las listas de masas teóricas de las proteínas depositadas en una determinada base de datos (Swiss-Prot, TrEMBL, NCBI). Esto se conoce como peptide mass fingerprint (PMF) y fue desarrollado en 1993 por diversos grupos simultáneamente. Como prerrequisito para la identificación fiable de proteínas por PMF se encuentra que la secuencia de la proteína de interés esté depositada en la base de datos y que la cobertura de secuencia de la misma sea por lo menos de un 50-60 %. En caso contrario, la identificación no es válida y no se pueden encontrar modificaciones post-traduccionales en base a dichas masas. La PTM de una proteína implica una variación en la masa del péptido desnudo que puede ser detectada con una medida precisa de la masa molecular del mismo (Jensen 2004). La técnica MALDI-TOF presenta las características idóneas para la identificación de PTMs en proteínas separadas en 2-DE (Jensen 200). En esta estrategia de identificación de PTMs, primero se pretende encontrar el máximo número de masas correspondientes a péptidos de la secuencia de interés, y después las modificaciones se identifican examinando las masas peptídicas reales y comparándolas con datos teóricos utilizando software específicos (Mascot). Para la identificación de PTMs, se establecen algoritmos de búsqueda que comparan la lista de masas obtenidas experimentalmente con la lista de masas teóricas de las proteínas de la base de datos en el caso de que presentaran la modificación correspondiente (Aebersold y Mann 2003). Para determinar si la anterior asignación teórica de los spots es correcta, se utilizó un análisis de los mismos por espectrometría de masas. 500 ¿g de proteína total aislada de células sometidas a hambre de nitrógeno durante 20 horas fueron separados por 2-DE y los 5 spots con reactividad por el anticuerpo específico para GlnK fueron analizados por MALDI-TOF previa digestión con tripsina. La lista de masas obtenida se utilizó para una búsqueda de Peptide Mass Fingerprint en Mascot y los resultados indicaron que los spots 1, 2 y 3 corresponden a GlnK1 mientras que los spots 4 y 5 corresponden a GlnK2. Una vez los spots fueron identificados como GlnK, se realizó la búsqueda de PTMs. Dado que las proteínas PII de otros organismos sufren uridililación o adenililación en un residuo de tirosina del T-loop, o bien fosforilación en un residuo de serina también del T-loop, estas PTMs fueron introducidas como ¿modificaciones variables¿ en la búsqueda con Mascot de los resultados del análisis por MALDI-TOF. En cuanto a la uridililación, se encontraron picos cuya masa correspondía a péptidos cubriendo el T-loop más exactamente 306 Da (peso molecular del UMP). Esto confirma la presencia de un grupo UMP en dicho péptido. Esta situación se encontró en los spots 2 y 4, pero no en los 1, 3 ó 5. No se encontraron péptidos adenililados o fosforilados con la misma aproximación. Por tanto, los spots 2 y 4 corresponden a las formas uridililadas de GlnK1 y GlnK2, respectivamente, mientras que los spots 3 y 5 deben corresponder a las formas no modificadas de las mismas, dado que la uridililación es una modificación que disminuye el pI. Finalmente, el spot 1 debe corresponder a una segunda PTM no identificada. 5. Interacción de GlnK con GS Las proteínas PII, en su papel como reguladores del metabolismo del nitrógeno, interaccionan con un gran número de proteínas del extracto celular; entre ellas, la glutamina sintetasa (GS) fue identificada en Methanosarcina mazei (Ehlers et al. 2005). El modelo típico de regulación de GS (E. coli) se basa en la modificación covalente de la misma por adenililación, catalizada por GlnE (Stadtman 2001), sin embargo dicha enzima no se identificó en un blast del genoma de Hfx. mediterranei. La búsqueda de una interacción GS-GlnK en Hfx. mediterranei fue motivada por la identificación de la misma en un organismo del Domino Archaea y la ausencia de glnE en el genoma del organismo de trabajo. El plan experimental consistió en la obtención de GS y GlnK recombinantes y el análisis de la variación en la actividad GS por la presencia de GlnK, además de la capacidad de las mismas para crear complejos. Obtención de las proteínas recombinantes GS es la enzima que cataliza la incorporación de amonio a L-glutamato con gasto de ATP para producir L-glutamina. Su actividad puede medirse detectando la producción de fosfato inorgánico (Shapiro & Stadtman 1970). El genoma de Hfx. mediterranei presenta 3 ORFs con homología por glutamina sintetasa; de los cuales GS3 conserva mejor los motivos conservados de la familia. Estudios previos identificaron una actividad GS in vivo (Martínez-Espinosa et al. 2006) y durante este trabajo, el análisis nano-ESI MS/MS de dicha proteína estableció que se trata de GS3. El gen codificante para GS3 se clonó en pET3a y la proteína se obtuvo como cuerpos de inclusión que se solubilizaron, replegaron y purificaron en una columna DEAE-celulosa. Una filtración en gel mostró un pico de 580 ± 40 kDa, indicando que la proteína es un dodecámero (Brown et al. 1994). Por lo que respecta a GlnK, ambos genes fueron clonados en pET14b para obtener las proteínas recombinantes como fusiones con una cola de histidinas. Crosslinking con glutaraldehido de las proteínas purificadas por afinidad por níquel mostró estructuras triméricas (45 kDa). Efecto de GlnK1 y GlnK2 sobre GS Para comprobar si las proteínas GlnK afectan a GS3, los valores de actividad biosintética de la misma se compararon en presencia y ausencia de los reguladores. La actividad GS aumentó 12 veces en presencia de 10 mM de 2-oxoglutarato pero hasta 18 veces en presencia de 2-oxoglutarato y una de las proteínas GlnK. Controles negativos en presencia de una cantidad 10 veces mayor de BSA no mostraron un aumento de actividad debido a interacciones inespecíficas. En una mezcla carente de 2-oxoglutarato la actividad de GS no fue alterada por GlnK, mientras que en presencia de dicho efector, el aumento de actividad GS fue proporcional a la cantidad de GlnK añadida Los resultados fueron equivalentes para cualquiera de las dos GlnK. Por tanto, el aumento de la actividad GS por GlnK depende de la presencia de 2-oxoglutarato. Formación de un complejo GS-GlnK en presencia de 2-oxoglutarato El incremento en la actividad de GS por presencia de GlnK sugirió la existencia de una interacción directa entre ellas. Para comprobarlo, mezclas de GS con cada una de las GlnK, además de cada una de las proteínas por separado, se sometieron a cromatografía de filtración en gel. El experimento se realizó por duplicado, utilizando dos tampones diferentes: en presencia o ausencia de 15 mM 2-oxoglutarato. Los patrones de elución fueron idénticos en ambas condiciones. Primero, los patrones de elución de las proteínas puras fueron analizados por SDS-PAGE, además de medidas de actividad para GS o inmunoblot para GlnK; se observó que no existía un solapamiento entre las fracciones de elución de GlnK y las de GS. Por tanto, la presencia de GlnK en el pico de elución de GS en las mezclas indicaría la existencia de una interacción entre ellas estable a lo largo de la cromatografía. Las muestras en las que ambas proteínas estaban presentes no mostraron una variación en la posición de los picos de elución, por tanto para comprobar la coelución de GlnK con GS, las fracciones de elución correspondientes al pico de GS (de menor volumen de elución, mayor tamaño) se sometieron a inmunoblot con anticuerpos específicos para GlnK. Tanto GlnK1 como GlnK2 fueron detectadas en el pico de elución de GS para las cromatografías en presencia de 2-oxoglutarato, resultados que indican la formación de un complejo estable y dependiente de 2-oxogluratato entre ambas proteínas. 6. Interacción de GlnK con Amt Los reguladores GlnK se definen como parálogos de GlnB cuyo gen se encuentra codificado en el genoma adyacente a un gen amt. El par GlnK-Amt parece ser uno de los aspectos más conservados del control del metabolismo del nitrógeno y la interacción entre los mismos el rol ancestral de las proteínas PII (Javelle & Merrick 2005). Dicha interacción ha sido experimentalmente identificada en numerosos organismos, pero nunca en uno del Dominio Archaea. Para identificar esta interacción en Hfx. mediterranei se utilizó una aproximación basada en inmunoprecipitación de los transportadores Amt marcados con una cola Flag. La presencia de GlnK coinmunoprecipitada en las fracciones de elución demostraría la existencia de una interacción estable entre ambas proteínas. Para ello, se construyeron 4 cepas flag:amt, introduciendo la cola Flag en los extremos N- ó C-terminal de Amt1 o Amt2, tal como aparece descrito previamente. Como primer paso, se utilizó un inmunoblot con anticuerpos específicos para el péptido Flag para identificar la localización celular de las proteínas Amt. Únicamente las fracciones de membrana de la cepa HM26-F3 (amt1:flag) mostraron señales del tamaño correcto, demostrando por primera vez en haloarchaea que las proteínas Amt se encuentran en la membrana. A la vista de los resultados anteriores, la cepa HM26-F3 se utilizó para los estudios de inmunoprecipitación. Para ello las células se crecieron en medio complejo y se sometieron a hambre de nitrógeno durante 48 horas antes de introducir un pulso de amonio (150 mM NH4Cl, 1 hora) para forzar la hipotética migración de GlnK hacia la membrana (Coutts et al. 2002). Las proteínas de las fracciones de membrana fueron solubilizadas con Tritón X-100 y sometidas a inmunoprecipitación (IP) utilizando anticuerpos inmovilizados específicos para el Flag-Tag. La cepa HM26 se utilizó como control negativo. Antes de la IP, la pureza de las membranas fue analizada midiendo la actividad de una proteína citoplasmática (ICDH). Las fracciones de elución de la IP fueron sometidas a inmunoblot con anticuerpos específicos para GlnK identificándose la presencia de ambas GlnK en la elución de HM26-F3, pero no en la de HM26, lo que demuestra que existe una interacción específica entre Amt1 y los reguladores GlnK. Reversibilidad de la interacción Amt-GlnK Para determinar si la interacción Amt-GlnK es reversible, se realizaron una serie de estudios en los que células de la cepa HM26 se sometieron a distintas fuentes de nitrógeno de forma cíclica: células crecidas en medio complejo se sometieron a hambre de nitrógeno y posteriormente a un pulso de amonio para finalmente ser devueltas a un medio carente de nitrógeno. Para cada muestra se obtuvieron fracciones de proteína total así como fracciones de citoplasma y membrana, sometidas éstas últimas a controles de pureza con ensayos de actividad de ICDH. Un inmunoblot con anticuerpos para GlnK de las fracciones anteriores mostró que no existe expresión de las mismas durante el crecimiento en medio complejo, mientras que se expresan masivamente en hambre de nitrógeno. Además, un pulso de amonio mostró una rápida acumulación de GlnK en la membrana mientras que la cantidad total de la misma en la célula disminuye paulatinamente. Sin embrago, cuando las células son devueltas a un medio carente de nitrógeno, GlnK desaparece de la membrana y el contenido celular total aumenta de nuevo. Estos resultados confirman la reversibilidad de la interacción. Conclusiones Las proteínas GlnK desarrollan en Hfx. mediterranei un papel como activadores del metabolismo del nitrógeno, ya que no se expresan cuando las condiciones de crecimiento involucran las fuentes de nitrógeno preferidas (amonio, extracto de levadura): GlnK1 es el regulador principal mientras que GlnK2 actúa para ayudar a la célula a ajustarse a períodos de estrés por deficiencia de nitrógeno. Dado que ambas proteínas parecen ser capaces de desarrollar las mismas funciones (interaccionar con GS y Amt), su rol in vivo debe estar relacionado con su patrón de expresión: GlnK1 se expresa tanto en hambre de nitrógeno como durante el crecimiento con fuentes de nitrógeno no óptimas (nitrato, fuente pobre desde el punto de vista energético al tenerse que reducir en el interior de la célula), mientras que GlnK2 se expresa únicamente bajo condiciones estrés por ausencia de nitrógeno. Las proteínas GlnK se modifican covalentemente por uridililación, proceso que probablemente esté involucrado en ajustar y afinar las propiedades reguladoras de las mismas. La expresión de GlnK en Hfx. mediterranei responde a la disponibilidad de nitrógeno del medio para ayudar a la célula a adaptarse al ambiente. En ausencia de amonio (fuente de nitrógeno preferida), se expresan una enzima que presenta alta afinidad por el mismo (glutamina sintetasa) y la proteína reguladora capaz de incrementar su actividad por interacción directa (GlnK1). Cuando las condiciones ambientales son más severas (hambre de nitrógeno), un segundo homólogo (GlnK2) se expresa para obtener una respuesta aún mayor. Por otra parte, si aparece de forma súbita un aporte de amonio en el medio, las proteínas GlnK son capaces de interaccionar con los transportadores de membrana Amt para regular la entrada en la célula de dicha molécula. Los resultados de este trabajo permiten, pues, modelar un mecanismo de respuesta de este organismo a la disponibilidad de nitrógeno del ambiente.