Modelos experimentales para el estudio de receptores de cannabinoides, citoesqueleto y motilidad en el espermatozoide humano

Resumen

El proceso de fertilización se lleva a cabo a través dos células o gametos, el espermatozoide y el ovocito. La calidad y funcionalidad de ambos gametos es fundamental para el éxito de la vida. Sin embargo, el espermatozoide debe superar muchos más obstáculos en su largo camino por el tracto genital femenino. Convencionalmente, la capacidad del espermatozoide de fecundar al ovocito, se analiza a través de un seminograma del eyaculado, evaluando diferentes parámetros como la motilidad, viabilidad y concentración. Sin embargo, en esta etapa de su maduración los espermatozoides son incapaces de fertilizar al ovocito. La capacidad de fecundación, la adquiere el espermatozoide in vivo, en su activación por el tracto genital femenino. La capacitación involucra diversos cambios estructurales, moleculares y funcionales, incluyendo una hiperactivación de la motilidad, un aumento de la concentración intracelular del ión calcio y un incremento en la fosforilación proteica. Así, una vez capacitado el espermatozoide puede experimentar la reacción acrosómica cuando se encuentra con el ovocito. Tanto la capacitación como la reacción acrosómica son eventos muy importantes en capacidad fecundante del gameto masculino, sin embargo, aún se desconocen todos los cambios funcionales, estructurales y moleculares implicados en ellos. Así, el estudio en profundidad de los marcadores moleculares de la capacitación y reacción sería muy importante para el entendimiento de la fisiología de la fecundación. Los cambios moleculares y funcionales producidos en el espermatozoide humano a través de su paso por el tracto reproductor femenino son muy importantes para conocer detalladamente la fisiología de la reproducción. Así, el principal objetivo de esta tesis doctoral fue determinar novedosos cambios moleculares que se producen durante la capacitación y reacción acrosómica del espermatozoide humano. Estos cambios incluyeron la redistribución de receptores membranales, cambios en proteínas del citoesqueleto y localización de enzimas relacionadas con el metabolismo energético. En particular los objetivos específicos de esta tesis doctoral fueron: 1. Caracterizar mediante inmunocitoquímica la novedosa presencia de glutamina sintetasa en el espermatozoide humano y evaluar la proporción de espermatozoides inmunoreactivos en muestras frescas, capacitadas y reaccionadas acrosómicamente. 2. Evaluar la presencia y distribución del receptor de cannabinoide tipo 1 (CB1) y tipo 2 (CB2), en espermatozoides humanos frescos, capacitados y reaccionados acrosómicamente. Además, cuantificar la proporción de espermatozoides reactivos a través de patrones de localización de cada tipo de receptor. 3. Determinar el efecto de los endocannabinoides 2-araquidonilglicerol (2-AG) y 2-araquidonilglicerol éter (2-AGE) en las funciones in vitro y características moleculares del espermatozoide humano. Estas incluyeron evaluación de la motilidad, viabilidad, reacción acrosómica y fosforilación proteica de muestras frescas y capacitadas. 4. Conocer los cambios que se producen en el citoesqueleto a través de la localización subcelular y cuantificación del área inmunoreactiva de α-tubulina en espermatozoides frescos, capacitados y reaccionados acrosómicamente. Resultados y Conclusiones -Respecto a la Identificación y localización subcelular de la Glutamina Sintetasa en espermatozoides humanos 1. Por primera vez se describe la presencia de glutamina sintetasa en el espermatozoide humano, y esta se localiza específicamente en la región post-acrosomal de la teca perinuclear. Si bien existen datos sobre su presencia en espermatozoides de búfalo, aún se desconoce su funcionalidad. 2. Las muestras capacitadas y reaccionadas acrosómicamente presentan un mayor porcentaje de espermatozoides inmunoreactivos para la glutamina sintetasa. El aumento de células espermáticas con esta enzima podría deberse al mayor número de espermatozoides móviles que presentan estas muestras. Aunque el mecanismo por el cual esta enzima se relaciona con la motilidad no se conoce, podría estar vinculado con la producción energética como ocurre en otras células. -Respecto a la Expresión y distribución subcelular del receptor de cannabinoide tipo 1 y tipo 2, en espermatozoides humanos frescos, capacitados y reaccionados acrosómicamente 1. Solo un pequeño porcentaje de espermatozoides expresan en su membrana el receptor de cannabinoide tipo 1 (CB1) o tipo 2 (CB2). Estos receptores están íntimamente relacionados con la regulación de canales de calcio, los cuales permiten el aumento intracelular de este catión durante las fases tempranas de la capacitación espermática. Así, los espermatozoides que expresen estos receptores podrían ser los seleccionados para llegar a fecundar al ovocito, aunque esta hipótesis deberá ser confirmada. 2. El CB1 y CB2 se encuentran en los espermatozoides de las tres situaciones experimentales estudiadas. Esto sugiere la necesidad de la presencia de estos receptores en todo el proceso de maduración espermática a través del tracto genital femenino. En concreto, podrían actuar regulando la capacitación y reacción acrosómica. 3. En el proceso de capacitación y reacción acrosómica existe una redistribución espacial de los receptores de cannabinoides. Así, el CB1 se localiza principalmente en la región post-acrosomal de espermatozoides frescos y capacitados; y el CB2 en la región post-acrosomal y pieza intermedia. En los espermatozoides reaccionados acrosómicamente, el CB1 y el CB2 se localizan mayoritariamente en el flagelo. Esto parece indicar que el CB1 y CB2 presentan un desplazamiento desde la cabeza hacia el flagelo, a medida que el espermatozoide pasa por los diferentes estados fisiológicos previos a la interacción con el ovocito. -Respecto al Efecto de los endocannabinoides, 2-araquidonilglicerol y 2-araquidonilglicerol éter, en las funciones in vitro del espermatozoide humano 1. El 2-araquidonilglicerol y 2-araquidonilglicerol éter producen una disminución de la motilidad progresiva en espermatozoides humanos frescos. Este evento podría estar relacionado con un declive de la actividad mitocondrial, como ha sido demostrado en otros endocannabinoides y citado en la discusión. 2. Aunque se ha demostrado que algunos endocannabinoides producen la inhibición de la reacción acrosómica, nuestros datos muestran que el 2-araquidonilglicerol produce el efecto contrario. Esto podría deberse a las diferentes afinidades de unión entre los endocannabinoides y sus receptores. 3. El 2-araquidonilglicerol causa una disminución del porcentaje de espermatozoides con fosforilación proteica. En este sentido, ha sido ampliamente demostrado que la fosforilación proteica es la principal modificación post-translacional implicada en el proceso de capacitación. Así, las bajas concentraciones de endocannabinoides encontradas en el tracto genital femenino permitirían que los espermatozoides se capaciten fosforilando sus proteínas. -Respecto a la Inmunolocalización y cuantificación de α-tubulina en espermatozoides humanos frescos, capacitados y reaccionados acrosómicamente 1. Los espermatozoides frescos, capacitados y reaccionados acrosómicamente pueden ser clasificados en dos poblaciones dependiendo del porcentaje de su flagelo inmunoreactivo para la α-tubulina. Así, existe una población con la mitad o menos de su flagelo inmunoreactivo para α-tubulina, y otra con más de la mitad. La expresión diferencial de α-tubulina podría estar relacionada con procesos de selección negativa, donde los espermatozoides con alta expresión de tubulina serían blanco de las caspasas, las cuales mediarían la apoptosis de estas células. 2. En la población con baja expresión, la inmunoreactividad de α-tubulina es aún menor en espermatozoides reaccionados acrosómicamente que en frescos y capacitados. En este sentido, el reordenamiento de muchas proteínas del citoesqueleto es un evento que sucede durante la reacción acrosómica. Así, la disminución de la expresión de α-tubulina podría ser un hecho necesario para que se produzca la reacción acrosómica en espermatozoides humanos. Sin embargo, esto deberá ser confirmado por estudios posteriores.