Perfil fenotípico y capacidad inmunomoduladora de distintos clones de células troncales mesenquimales

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) son un grupo heterogéneo de células multipotentes que pueden ser aisladas de distintos tejidos, como cordón umbilical, médula ósea, sangre periférica, placenta o tejido adiposo. Dichas células fueron descritas por primera vez por Friedenstein en 1968 y, a día de hoy, no existe ningún marcador con el cual se pueda diferenciar una célula mesenquimal de otra célula madre y para ello, la Sociedad Internacional de Terapia Celular las define mediante los siguientes criterios. - Tienen que ser células adherentes al plástico -Deben expresar los marcadores de superficie celulares CD73, CD90 y CD105 y no expresar CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79alpha, CD19 y HLA-DR. -Deben tener la capacidad para diferenciarse, bajo las condiciones apropiadas in vitro, en osteoblastos, adipocitos, condroblastos y células del tejido nervioso. Las MSC tienen propiedades inmunológicas únicas, que han hecho de éstas células un foco de interés en el campo de la terapia celular. Éstas con capaces de escapar al reconocimiento inmune y no provocan proliferación de linfocitos en co-cultivos alogénicos, debido a la ausencia o baja expresión de HLA-II. Además, no sólo no provocan la proliferación de linfocitos por su baja inmunogenicidad, sino que inhiben la proliferación de éstos cuando son estimulados in vitro con estímulos tales como PHA; PMA+Io, anti-CD3, etc. Esta función inmunomoduladora de las MSC, fue descrita por primera vez en el año 2000 por Lietchty, pero los mecanismos mediante los cuales las MSCs ejercen dicha función inmunomoduladora son, todavía, desconocidos. El contacto célula-célula o la liberación de factores solubles pueden ejercer un papel esencial. En cuanto a la terapia celular con MSCs, el primer ensayo clínico fue en 1995 y, desde ese momento, el número de ensayos ha ido en aumento, hasta que, a día de hoy, hay en curso más de 200 ensayos clínicos para distintas enfermedades, tales como cáncer, diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, etc. con resultados positivos y negativos. No obstante, debido al bajo número de pacientes tratados, no se ha podido establecer una conclusión definitiva de la seguridad del tratamiento con dichas células. Publicaciones recientes han demostrado la capacidad de las MSCs para aumentar in vitro la frecuencia de células Treg, postulándose que éste puede ser precisamente uno de los principales mecanismos responsables de la inmunomodulación ejercida por las MSCs. Ello podría tener importantes implicaciones clínicas, tanto en el campo de los alotransplantes, para tratar el rechazo inmunológico mediante el establecimiento o inducción del proceso de tolerancia inmunológica, como en patologías autoinflamatorias/ autoinmunes, al reestablecer la tolerancia inmunológica perdida; e incluso, permitiría reducir la dosis de los fármacos inmunosupresores habitualmente utilizados en estas enfermedades, con la consiguiente disminución de efectos secundarios. Zuk et al. demostraron que el tejido adiposo contiene MSCs con propiedades similares a las aisladas de médula ósea y en mayor abundancia y las denominó ASC (adipose stem cells). Además, la obtención es menos invasiva, ya que se pueden aislar a partir de una simple liposucción. Por otro lado, la mayoría de los trabajos publicados relacionados con MSCs, son trabajos en los cuales se han utilizado poblaciones heterogéneas de MSCs y no poblaciones homogéneas clonogénicas. Por lo tanto, es importante estudiar y analizar poblaciones clonales de MSC para determinar fielmente estas diferencias inter e intraindividuales, con el objetivo último de poder identificar con mayores garantías aquellos clones con un mayor potencial terapéutico. Esta búsqueda también se puede establecer a partir de sus diferentes propiedades inmunomoduladoras, trascendentales para su papel en terapia celular. Dado el efecto de las msc sobre prácticamente todas las células del sistema inmunitario, queda patente la necesidad de caracterizar al máximo dichas poblaciones, especialmente en el caso de querer utilizarlas en protocolos de terapia celular. Esta búsqueda, a falta de marcadores específicos, debiera realizarse basándose en sus propiedades ex vivo para modular y modificar el comportamiento de las distintas poblaciones de células del sistema inmunitario. Dada la enorme heterogeneidad de las msc, la clonación a partir de una sola célula se antoja como la manera más sencilla y óptima de generar poblaciones homogéneas, que nos permitan por un lado identificar con la máxima fiabilidad su potencial inmunomodulador y, por otro lado, elegir el clon más adecuado en cada caso para realizar una terapia celular dirigida y eficaz. OBJETIVOS El principal objetivo de este trabajo fue demostrar que los clones procedentes de poblaciones heterogéneas de ASC presentan diferentes capacidades inmunomoduladoras. Para ello decidimos caracterizar fenotípica y funcionalmente cinco clones de ascprocedentes de dos donantes sanos diferentes. Para llevar a cabo dicha caracterización, nos planteamos desarrollar ex vivo los siguientes objetivos específicos: 1. Caracterizar el fenotipo de membrana de los distintos clones de ASC, de acuerdo al porcentaje de expresión e intensidad mediana de fluorescencia de los antígenos cd44, cd73, cd90 y cd105. 2. Caracterizar el perfil de citocinas de los secretomas procedentes de cada uno de los clones de ASC. 3. Caracterizar el balance de citocinas Th1/Th2/Th17, en los sobrenadantes de cocultivos de los distintos clones de ASC con PBMC. 4. Analizar el efecto de los clones de ASC sobre la proliferación de distintas poblaciones y subpoblaciones de PBMC otales, así como su efecto sobre distintas subpoblaciones de linfocitos T purificados. 5. Evaluar la capacidad moduladora de los distintos clones de ASC, sobre la población de células Treg. 6. Analizar el efecto de los secretomas de cada uno de los clones de ASC, sobre la proliferación de PBMC totales, así como su efecto modulador sobre la población de células Treg. 7. Determinar el efecto de los distintos clones de ASC sobre la viabilidad de PBMCS. 8. Establecer diferencias interclonales basadas en el conjunto de los objetivos anteriores, que nos permitan caracterizar patrones de comportamiento diferentes que, potencialmente, pudieran utilizarse en la optimización de los protocolos de terapia celular con msc. MATERIAL Y MÉTODOS Aislamiento y expansión de MSCs: Los clones de ASCs serán cedidos altruistamente por el grupo de investigación del Dr. Enrique Roche (Instituto de Bioingeniería, UMH, Elche), con el cual vamos colaborando de manera rutinaria a lo largo de los últimos años. Aislamiento de poblaciones linfocitarias: Las PBMC se obtendrán mediante técnica de gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque a partir de sangre periférica en EDTA, obtenida de voluntarios sanos. Para el resto de poblaciones se utilizarán los siguientes kits: -"RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail", que contiene unos complejos de anticuerpos tetraméricos que reconocen CD8, CD16, CD19, CD36, CD56, CD66b, TCR/ y glicoporina A. Estos anticuerpos se incuban con la sangre periférica antes de realizar la separación por gradiente de densidad (Fycoll-Hypaque). Dichos complejos hacen que las células no deseadas, tras la centrifugación, se encuentren en el pellet, mientras que las células CD4+ se sitúen en la interfase entre el medio de separación y el plasma. Para el resto de poblaciones linfocitarias se utilizarán respectivamente los kits “RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail" y “RosetteSep Human CD3+ T Cell Enrichment Cocktail". Fenotipo de membrana de MSCs: Los diferentes clones de MSC serán lavados dos veces con PBS, tripsinizados (5’ con Tripsina-0,1%EDTA 37ºC) y resuspendidos en 4 mL de DMEM. Se procederá a contar mediante cámara de Neubauer y se centrifugarán para resuspender en el volumen adecuado para realizar el marcaje (1•10e6 células/mL). Se marcarán por inmunofluorescencia directa mediante anticuerpos monoclonales para CD73, CD105, CD90, CD45, CD19, CD34, CD14, etc. conjugados con distintos fluorocromos. Se procederá a medir mediante citometría (EPICS XL COULTER) de flujo la intensidad/porcentaje de dichos marcadores. Análisis de citocinas: Las citocinas se podrán medir tanto intracelularmente como en sobrenadante de cultivo. El porcentaje de células que producen citocinas, se puede determinar utilizando un inhibidor de la secreción (Brefeldina A), que permite el acumulo de las mismas en el citoplasma. A continuación, tras la permeabilización de la membrana celular, se detecta la presencia de dichas citocinas en el citoplasma mediante citometría de flujo con anticuerpos monoclonales específicos de las mismas, marcados con fluorocromos. Para el análisis de los sobrenadantes de cultivo, utilizaremos el kit Flowcytomix TM Multiplex Test Th1/Th2/Th17 (eBioscience), que permite medir simultáneamente las siguientes citocinas: IL-1, TNF-a, TNF-b, IL-2, IL-4, IL-5, IL6, IL-8, IL-10, IL-12 e INF-g. Se medirán los sobrenadantes de cultivos de ASCs estimuladas con distintos estímulos, tales como PHA, LPS, PMA + Io, etc. y como control negativo se medirán las ASCs sin estimular. Ensayos de proliferación: Las diferentes poblaciones linfocitarias (PBMNc totales y poblaciones purificadas), se resuspenderán en medio de cultivo (RPMI) suplementado con glutamina, suero de ternera fetal y antibiótico y se incubarán en estufa a 37ºC con 5% de CO2 y saturada de humedad, solas o combinadas, sin estímulos (control negativo del cultivo) o estimuladas durante 96 horas (control positivo) con PHA (10ug/ml) y/o anti-CD3+CD28 (10uL+2uL) y/o LPS (1 ug/ml), dependiendo de la población a estimular. Todas las poblaciones linfocitarias se primarán antes del cultivo con diacetato de 5-carboxifluoresceína (CFDA-SE, Coulter) durante 5 minutos, de acuerdo con el protocolo estandarizado (Current Protocols on Immunology). La estimulación se realizará también en presencia o ausencia de clones diferentes de ASCs alogénicas, buscando con ello un posible efecto modulador de dichas células sobre las poblaciones linfocitarias. Para ello, será necesario disponer de dichos clones de ASC previamente expandidos in vitro, que antes de ser sembrados en las placas de cultivo de 96 pocillos, serán lavados, tripsinizados y resuspendidos en el mismo medio de cultivo RPMI que el utilizado para las poblaciones linfocitarias. La proporción MSC/linfocitos será de 1/10 y de 1/5. CONCLUSIONES 1.- Según el grado de coexpresión de los diferentes antígenos de membrana analizados, observamos tres patrones diferentes. Por un lado estarían los clones 3.x, que presentaron un comportamiento más homogéneo que el resto de clones y mayor cantidad de antígenos. Por otro lado, los clones 1.10 y 1.22, que en conjunto presentaron la menor cantidad de antígenos. Finalmente el clon 1.7, que podríamos definir como un fenotipo intermedio entre los otros dos. 2.- Los clones 1.7 y 3.x, produjeron espontáneamente mayores cantidades de las citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-8 y los clones 1.7, 1.22 y 3.10 presentaron una cinética de producción más rápida. Tras la estimulación, los clones 3.xmostraron un perfil más proinflamatorio, mientras que los clones 1.10 y 1.22 presentaron un perfil más supresor. El clon 1.7 mostró de nuevo un comportamiento más parecido al de los clones 3.x, especialmente en lo relacionado a los niveles máximos de citocinas. 3.- En los cocultivos observamos dos patrones de comportamiento distintos. Generalmente, la presencia de los clones 1.7 y 3.10 se acompañó de niveles altos de citocinas en el medio, al contrario de lo que ocurrió con los clones 1.10, 1.22 y 3.5. El clon 1.7 fue el que se relacionó con niveles más altos de las principales citocinas proinflamatorias y el clon 1.10 el que presentó una mayor capacidad inmunosupresora. 4.- Los clones del estudio mostraron capacidades diferentes a la hora de inhibir la proliferación. En el cocultivo con PBMC totales, los clones 1.x fueron en conjunto más supresores que los clones 3.x, siendo el 3.10 el menos inhibidor y el 1.22 el más inhibidor. En el caso de los cocultivos con linfocitos T cd3+ y cd4+ purificados, los clones 1.7 y 3.10 fueron los que mostraron menor capacidad de inhibición, al contrario que los clones 1.10 y 3.5, que fueron doblemente supresores. 5.- En el caso de los linfocitos T cd8+ purificados y al contrario de lo anteriormente observado con las otras poblaciones leucocitarias analizadas, los cocultivos con ASC mostraron un aumento de la proliferación respecto de la condición sin ASC. Los clones 1.7 y 3.10 fueron los que produjeron mayores aumentos, y los clones 1.10, 1.22 y 3.5 los que menos. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra este hecho, sentando a priori las bases para investigaciones futuras más detalladas sobre esta población. 6.- Aunque las ascparecen estar aumentando la proliferación de linfocitos T cd8+, ésta estaría afectando principalmente a una subpoblación de reconocido carácter supresor, como la cd8+cd11b. Estos resultados sugieren que las ascllevarían a cabo una parte de sus efectos inmunomoduladores, a través de un efecto indirecto sobre poblaciones reguladoras del sistema inmunitario, tal y como se describe en la Literatura para las Treg. En esta misma línea, nuestros clones también aumentaron la presencia de células Treg en los cocultivos con PBMC, de nuevo con intensidades diferentes, siendo el clon 1.22 el que mostró mayor incremento. 7.- Los secretomas de los distintos clones produjeron generalmente los mismos efectos que los observados en los cocultivos, tanto en la inhibición de la proliferación como en la variación del porcentaje de Treg, aunque siempre con una menor intensidad, lo que corrobora la importancia del contacto celular en la inmunomodulación llevada a cabo por estas células. 8.- Los clones de estudio mostraron en este caso efectos contrarios sobre la viabilidad de las PBMC. De hecho, el clon 3.5 aumentó la mortalidad de PBMC preincubadas con estímulos apoptóticos (UV), mientras que el clon 1.10 la disminuyó. 9.- Como conclusión final, la heterogeneidad de las MSC, lejos de tener que ser vista como un hándicap para la terapia celular, podría ser utilizada en nuestro favor en pro de una terapia mucho más optimizada. De hecho, y acorde a nuestros resultados, podríamos aprovechar las características particulares de cada clon descritas en el presente trabajo (utilizando clones aislados o aquellas combinaciones de clones más adecuadas en cada caso concreto), para activar o inhibir una determinada población o poblaciones leucocitarias, promover un balance final de citocinas anti o pro inflamatorias o un balance concreto Th17/Treg, o modificar la viabilidad de una población celular. Ello permitiría diseñar ex vivo la terapia personalizada más adecuada en cada caso, en función no sólo de la patología a tratar y de su grado de actividad, sino también del individuo que la va a recibir, lo que supondría un gran avance en el campo de la terapia celular.