Mecanismo cinético de la L-Alanina Deshidrogenasa de Halobacterium salinarum

Resumen

Se ha estudiado el mecanismo cinético de la L-Ala DH (L-Alanina: NAD+- oxidorreductasa EC.1.4.1.1) de Halobacterium salinarum (Archaea halófilo extremo). Tras la purificación de la Ala DH, se buscaron las condiciones apropiadas para la realización de los ensayos de aminación y desaminación: tampón Tris-HC1 0,1 M, pH 9,0, con KCL 3,6 M y t =40 C. Se procedió a investigar el mecanismo cinético mediante los métodos de velocidades iniciales, inhibición por producto, inhibición por análogos estructurales de los productos y empleo de sustratos alternativos. Los resultados obtenidos son consistentes con un mecanismo secuencial ordenado en el que los sustratos se unen a la enzima en el siguiente orden: NADH, Pyr y NH4+, y los productos se liberan: L-Alanina y NAD+-. El mecanismo supone un sistema de estado estacionario pero con una etapa de equilibrio rápido en la unión del Pyr, que queda confirmada por el método de inhibición por producto al producirse un complejo abortivo ("dead-end").