Adhesivos proteicos bioinspirados para calzado

Resumen

El uso de adhesivos de contacto convencionales provenientes de fuentes fósiles y en base disolvente, conlleva ciertos riesgos sobre el medioambiente y la salud. Actualmente, algunas industrias están trabajando para la incorporación de diferentes alternativas, como adhesivos de polímeros sintéticos en base acuosa y adhesivos termofusibles libres de disolventes en sus líneas de producción. Sin embargo, estas alternativas no resuelven el problema medioambiental asociado a los residuos poliméricos no biodegradables. En la naturaleza se ha observado la existencia de diversos sistemas de adhesión naturales que permiten a los organismos vivos su adherencia a una gran variedad de sustratos de diferente naturaleza, incluso en condiciones altamente adversas a través de diversas proteínas extracelulares. Tan peculiares características las hacen indicadas para explorar su posible aplicación como polímero base en la formulación de adhesivos para la industria del calzado incorporando una alternativa sostenible, ecológica y competitiva a los adhesivos convencionales. En el caso concreto de los microorganismos, la adhesión se produce mediante la formación de agregados en forma de biofilms. Generalmente, y en particular en el caso de los biofilms producidos por Bacillus subtilis, las células se encuentran embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares producidas por el propio microorganismo que pueden ser de interés en la búsqueda de nuevos adhesivos basados en biopolímeros. La expresión heteróloga es el método que más se ha aplicado en la producción de proteínas recombinantes durante los últimos años. La mayoría de estos sistemas emplean como hospedador Escherichia coli o Bacillus subtilis por su rápido crecimiento, su amplia caracterización genética, la disponibilidad de un gran número de cepas y de vectores de expresión, y su capacidad de producir proteínas a gran escala. En esta investigación se propone la obtención de proteínas adhesivas mediante técnicas de Microbiología Industrial y Biotecnología Microbiana como una respuesta a los problemas medioambientales y de salud de los operarios asociados a los adhesivos convencionales empleados en la industria del calzado. Los resultados obtenidos en este trabajo de investigación se describen a continuación: En primer lugar se ha seleccionado una proteína con esperables propiedades adhesivas. La proteína diana se ha determinado mediante una búsqueda bibliográfica de proteínas con propiedades adhesivas conocidas y un posterior estudio comparativo, a nivel de secuencia aminoacídica, estableciendo porcentajes de homología entre las diferentes candidatas. Es frecuente que dos proteínas que tengan un alto porcentaje de homología en su secuencia aminoacídica presenten una gran similitud en la función que desarrollan. En la selección de la proteína definitiva se han evaluado las ventajas e inconvenientes de la manipulación, tanto de las proteínas como del microorganismo del que provienen. A continuación se ha evaluado la participación de la proteína en fenómenos de adhesión celular. El gen que codifica para la proteína seleccionada, incluyendo su péptido señal, ha sido subclonado en un vector de expresión constitutiva (sobreproductor). De esta forma, se ha dispuesto de dos sistemas que poseen la proteína con el mismo plegamiento y localización: la cepa silvestre y la cepa silvestre transformada con una construcción de forma que la proteína quede sobreexpresada de forma constitutiva. Así, ha sido posible evaluar qué aspectos fisiológicos, estructurales y morfológicos de la cepa se ven alterados tras la sobreexpresión de la proteína objeto de estudio, incluyendo su capacidad de adhesión a superficies mediante la formación de biofilm. Para ello, se ha llevado a cabo la optimización y puesta a punto de un protocolo para la cuantificación de la formación de biofilm. Posteriormente se ha evaluado la expresión y purificación de la proteína MntA en un vector de expresión inducible. El gen de la proteína ha sido subclonado en un vector de expresión inducible por IPTG quedando una cola de histidinas, situada en el carboxilo terminal de la proteína. De esta forma, se favorece su posterior purificación mediante un sistema de matrices de cromatografía de Ni-NTA (ácido nitrilo acético) con afinidad por biomoléculas con seis residuos de histidina consecutivos. Se ha llevado a cabo la optimización y puesta a punto de un método para la sobreexpresión y purificación de la proteína mediante un sistema de matrices de cromatografía de Ni-NTA. Así, una vez se ha obtenido la proteína MntA con una pureza y una concentración adecuada, ha sido posible la verificación de su identidad, así como la integridad de la misma. Finalmente se ha caracterizado estructuralmente la proteína MntA. Una vez se ha obtenido la proteína con una pureza y concentración aceptables, se ha llevado a cabo la caracterización estructural y funcional de la proteína purificada con el fin de evaluar su idoneidad como adhesivo para la industria del calzado. Conclusiones: 1. Se ha seleccionado la proteína MntA de Bacillus subtilis, que presenta un alto porcentaje de homología con proteínas adhesivas con función conocida. El análisis mediante diversas herramientas bioinformáticas indican que la proteína MntA presenta un péptido señal entre los aminoácidos 25 y 26 y que su localización más probable es en la membrana citoplasmática. Además, se trata de una proteína con tendencia a formar hélices alfa y éstas son susceptibles de formar hélices superenrolladas. Por otro lado, se ha observado la presencia del aminoácido lisina (Lys) como el más expuesto, resultado de gran interés a la hora de la búsqueda de posibles entrecruzadores. 2. Se ha construido un vector de clonación (pCSN73A2) en el que se ha mantenido el péptido señal de la proteína para dirigir y anclar la proteína a membrana. La expresión de la proteína, se ha regulado bajo el promotor constitutivo de la quitosanasa. 3. Se ha optimizado un ensayo de bioadhesión, mediante el cuál se ha comprobado que la proteína MntA participa en fenómenos de adhesión. A través de diferentes técnicas de microscopía, se ha verificado que la cepa sobreproductora forma un biofilm tridimensional estructurado con una matriz polimérica y que las bacterias son de un tamaño muy superior. 4. Tras subclonar la proteína (sin el péptido señal) en un vector de clonación inducible por IPTG (pQE60), se ha puesto a punto un procedimiento de sobreexpresión y purificación de la proteína mediante cromatografía de afinidad utilizando resina de níquel como fase estacionaria. Las condiciones de expresión establecidas son: crecimiento del cultivo en medio Lysogeny-Broth (LB) a 37 ºC y 220 rpm durante 2h y media seguido de una inducción de la expresión mediante IPTG 1 mM durante 3h y media a 37ºC y 220 rpm . Para la extracción y solubilización proteica antes de la purificación, se ha establecido el uso de un tampón de lisis junto con el surfactante Tritón X-100, seguido de un lisado enzimático y un lisado mecánico mediante sonicación y una disgregación mediante jeringa y aguja. 5. Durante la caracterización de la proteína, se ha observado que la proteína nativa presentaba un proceso de desnaturalización en torno a los 80 ºC, temperatura habitualmente utilizada en la reactivación de adhesivos de poliuretano convencionales. Dicho proceso es reversible, permitiendo su aplicación como adhesivo reactivable por temperatura. Además, las medidas de tensión superficial y de ángulos de contacto de las suspensiones acuosas de la proteína en estudio, indican que la proteína moja adecuadamente los materiales poliméricos utilizados habitualmente en la fabricación de pisos para calzado. 6. Tras la adición del glutaraldehído como agente reticulante a concentraciones de 4% o superiores, se produce una reticulación intermolecular, dando lugar a la formación de unidades oligoméricas de mayor tamaño (250 kDa o mayor). 7. Mediante ensayos de calorimetría diferencial de barrido se ha observado que tras la adición del agente reticulante, la proteína sufre un cambio conformacional debido al entrecruzamiento, que produce la desaparición del proceso de desnaturalización de la proteína, en las condiciones de análisis. Además, los ensayos de espectroscopía infrarroja, microscopía electrónica de barrido y cristalización muestran que la reticulación afecta a los motivos estructurales de la proteína, a su estructura terciaria y a su capacidad de formar cristales. 8. La idoneidad de los adhesivos bajo estudio para su uso en el pegado del piso al corte, la operación de pegado más exigente en la fabricación del calzado, ha sido evaluada mediante ensayos de pelado en T. Tras realizar la separación de las uniones, en el caso de las probetas en donde se había aplicado el adhesivo proteico, se observa la aparición de hilos debidos a un fallo de cohesión del adhesivo, no apreciándose fallos de adhesión a los materiales. Sin embargo, los valores obtenidos para la proteína objeto de estudio indicaban una resistencia muy reducida a la unión. 9. Los resultados obtenidos en este estudio son bastante prometedores, aunque todavía es necesario mejorar la formulación del adhesivo para poder ser utilizado como polímero base de adhesivos para aplicación en la industria del calzado.