Desarrollo y evaluacion de un metodo de diagnostico de micosis profundas mediante tecnicas de biologia molecular

Resumen

La incidencia de las infecciones fúngicas invasivas (IFIs) ha ido aumentando de manera notable en las últimas décadas. El motivo principal es que cada vez son más los pacientes con algún tipo de inmunosupresión o con distintos niveles de compromiso inmunológico. En la actualidad muchos esfuerzos se centran en el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico basadas en la detección de ácidos nucleicos más sensibles, específicas y rápidas que las técnicas convencionales de microscopía, cultivo e inmunología principalmente métodos moleculares basados en la detección de ácidos nucleicos, campo en el que se han alcanzado grandes avances. En este trabajo hemos optimizado y evaluado un método rápido y sensible para la detección de hongos en muestras clínicas basado en la amplificación mediante PCR semi-anidada con posterior secuenciación del DNA. Para ello empleamos tres regiones distintas del complejo ribosómico que nos permitieron realizar diagnóstico molecular de IFIs en base a dos estrategias diferentes de detección de hongos: identificación orientada, empleando cebadores específicos para Aspergillus spp (AFU7/AFU5) y Candida albicans (CTSR/CADET/CTSF), e identificación no orientada mediante cebadores panfúngicos (ITS1/ITS4/ITS86). En primer lugar se optimizaron para todos estos cebadores sus reacciones de amplificación con el fin de obtener la mayor sensibilidad posible ensayando diferentes concentraciones de cebadores y número de ciclos. A continuación cuantificamos la sensibilidad de nuestro método diagnóstico mediante un ensayo en agua y en distintos tejidos humanos, permitiéndonos comprobar su utilidad en la detección de hongos en diferentes tipos de muestra clínica (sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, líquido pleural y lavado broncoalveolar). La sensibilidad de la técnica para C. albicans fue de 1 célula/500 µl con los cebadores ITS1/ITS86/ITS4 en todos los tejidos