Efecto de un envejecimiento post-ovulatorio in vitro de ovocitos de ratón en presencia de ditiotreitol sobre ovocitos y embriones preimplantatorios

Resumen

Objetivo: Analizar el efecto del envejecimiento post-ovulatorio de ovocitos de ratón in vitro en presencia de diferentes concentraciones de ditiotreitol (DTT) sobre (1) fecundación y desarrollo embrionario hasta la fase de blastocisto; (2) niveles relativos de actividad glutatión S-transferasas (GSTs) y tioles, incluyendo glutatión reducido (GSH), en ovocitos; (3) niveles de actividad del factor promotor de la metafase (MPF) y protein-kinasas activada por agentes mitogénicos (MAPKs) en ovocitos; (4) activación partenogenética de ovocitos; (5) asignación celular al linaje de la masa celular interna (ICM) y trofectodermo (TE) en blastocistos; y (6) fragmentación del ADN en blastocistos. Material y métodos: Los ovocitos ovulados por hembras híbridas de ratón, de 7 a 9 semanas de edad, estimuladas con gonadotrofinas exógenas se envejecieron en presencia de 0, 5, 50 y 500 mM de DTT durante 6 ó 9 h antes de la inseminación in vitro, determinación de los niveles relativos de GSTs y tioles, y actividad MPF y MAPKs, o estimulación partenogenética con etanol, timerosal+DTT o roscovitina. Los niveles relativos de actividad GSTs y tioles en ovocitos se evaluaron mediante técnicas de microscopía confocal. Los niveles relativos de actividad MPF y MAPKs se determinaron mediante electroforesis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Los embriones resultantes de la fecundación in vitro se cultivaron hasta la fase de blastocisto. La asignación celular a la masa celular interna o al trofectodermo y fragmentación de ADN en blastocistos se evaluó utilizando técnicas de epifluorescencia. Resultados: El porcentaje de fecundación fue significativamente mayor en ovocitos incubados en presencia de 50 y 500 mM de DTT en comparación con los ovocitos expuestos a 0 y 5 mM de DTT. El envejecimiento de los ovocitos en presencia de 50 y 500 mM de DTT también tuvo efectos beneficiosos en el posterior desarrollo embrionario hasta la fase de blastocisto. El tratamiento de los ovocitos con 5, 50 y 500 mM de DTT contrarrestó la caída de los niveles de actividad GSTs y tioles asociada con el envejecimiento post-ovulatorio de los ovocitos. Los ovocitos envejecidos durante 9 h en presencia de 500 mM de DTT mostraron una mayor actividad MPF que los ovocitos incubados durante el mismo período en 0 y 5 mM de DTT. Los niveles de actividad MAPKs fueron significativamente menores en el grupo de 5 mM de DTT en comparación con los ovocitos frescos incubados durante 1 h en ausencia de DTT y los ovocitos envejecidos durante 9 h en presencia de 50 mM de DTT. En el grupo de ovocitos controles, no tratados, y el grupo de ovocitos tratados con roscovitina no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de activación partenogenética entre ovocitos incubados durante 1 h en ausencia de DTT ó 9 h en presencia de 0, 5, 50 or 500 mM DTT. En los grupos de ovocitos expuestos a etanol ó timerosal+DTT, los ovocitos frescos mostraron un menor porcentaje de activación partenogenética que los ovocitos envejecidos in vitro en 0, 5, 50 y 500 mM de DTT. Los ovocitos envejecidos in vitro en presencia de 500 mM de DTT mostraron un porcentaje significativamente mayor de activación partenogenética que los ovocitos envejecidos en 0, 5 y 50 mM de DTT. El envejecimiento de los ovocitos en presencia de 50 y 500 mM de DTT aumentó significativamente el número total de células en blastocistos comparado con el grupo de 0 mM de DTT. El tratamiento de los ovocitos con 5, 50 y 500 mM de DTT disminuyó significantemente el cociente entre número de núcleos con fragmentación del ADN y número de células de la ICM cuando se comparó con el grupo de 0 mM de DTT. El número de células de la ICM y el cociente ICM/TE en blastocistos fue significativamente mayor en los grupos de 50 y 500 mM de DTT que en el grupo de 0 mM de DTT. Conclusiones: El envejecimiento post-ovulatorio de ovocitos de ratón in vitro en presencia de DTT se asocia con (1) mayores porcentajes de fecundación y desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto; (2) mayores niveles relativos de actividad GSTs y tioles, incluyendo GSH, en ovocitos; (3) mayores niveles de actividad MPF y MAPKs en ovocitos; (4) ausencia de efecto sobre el potencial de activación partenogenética tras exposición a etanol o roscovitina, o mayor susceptibilidad tras tratamiento con timerosal+DTT; (5) mayor número de células de la ICM y cociente entre número de células de la ICM y TE en blastocistos; y (6) mayor porcentaje de núcleos con fragmentación del ADN en la ICM en blastocistos.