Desarrollo de métodos analíticos para el estudio de procesos derivados de la absorción percutánea de los filtros uv contenidos en los productos cosméticos para la protección solar

Zusammenfassung

El uso de productos cosméticos para la protección solar es necesario para minimizar los efectos dañinos que pueden ser provocados por la exposición prolongada a la radiación solar. Actualmente, los dermatólogos recomiendan el empleo de productos cosméticos para la protección solar no sólo en condiciones de exposición extrema al sol (p. ej., playa, nieve, etc.), sino también en situaciones cotidianas. Sin embargo, estas formulaciones cosméticas contienen en su composición compuestos químicos, comúnmente conocidos como filtros UV, que pueden dar lugar a procesos no deseados, tales como la absorción percutánea. El objetivo final de esta Tesis Doctoral ha sido el desarrollo y la validación de métodos de análisis basados tanto en metodologías in vitro como in vivo no invasivas. De este modo, se podrá obtener más información acerca de estos efectos secundarios no deseados asociados al empleo de los filtros UV contenidos en los productos cosméticos para la protección solar. La metodología in vitro más utilizada para estimar la absorción percutánea de los filtros UV se basa en el empleo de celdas de difusión. Por ello, se ha desarrollado un método analítico basado en la cromatografía de líquidos por interacción iónica con detección UV/VIS (LC-UV/VIS) para la determinación de los filtros UV hidrosolubles más utilizados en los productos cosméticos para la protección solar (fenil bencimidazol sulfónico (PBS), fenil bencimidazol tetrasulfonato disódico (PDT), tereftaliden dicanfor sulfónico (TDS) y benzofenona-4 (BZ4)) en el fluido receptor de celdas de difusión. Por su parte, los procedimientos in vivo incluyen la determinación de filtros UV en fluidos biológicos procedentes de voluntarios tras la aplicación de un producto cosmético para la protección solar conteniendo estos compuestos en su composición, bajo unas condiciones concretas. Debido al hecho de que los procesos de absorción percutánea de los filtros UV en humanos pueden traer consigo el desarrollo de procesos de biotransformación, acumulación y excreción, es mejor referirse a mecanismos de disposición corporal, como un término más general que incluya todos estos bioprocesos. Los filtros UV estudiados en esta Tesis Doctoral con metodología in vivo han sido la benzofenona-3, el etilhexil dimetil PABA y el metil benciliden canfor. Para comenzar con el estudio in vivo, se ha desarrollado un método de análisis basado en un procedimiento de extracción en fase sólida (SPE) acoplado por inyección secuencial a un sistema de cromatografía de líquidos con detección UV/VIS para determinar simultáneamente benzofenona-3 (BZ3) y benzofenona-4 (BZ4) en orina humana, que es considerada la principal vía de excreción de estos compuestos. Asimismo, teniendo en cuenta que la ruta de biotransformación de BZ3 está bien establecida, se ha desarrollado un método analítico sensible basado en un procedimiento SPE combinado con cromatografía de líquidos y un sistema de detección por espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la determinación de BZ3 y sus metabolitos de fase I (2,4-dihidroxibenzofenona (DHB), 2,2 '-dihidroxi-4-metoxibenzofenona (DHMB) y 2,3,4 trihidroxibenzofenona (THB)) en orina humana. En comparación con los métodos existentes, el método desarrollado permite la determinación simultánea de BZ3 y sus tres metabolitos en orina humana en un intervalo de concentraciones del orden de ng/mL. Considerando que la actividad estrogénica mostrada no sólo por BZ3 sino también por sus metabolitos, podría ser de gran interés una evaluación más profunda sobre los efectos toxicológicos de estos compuestos en el sistema reproductivo masculino. De este modo, se ha desarrollado y validado una metodología analítica basada en un procedimiento SPE combinado con LC-MS/MS para determinar BZ3, DHB, DHMB y THB en semen humano. Entre los filtros UV permitidos por la legislación europea que se pueden incluir en los productos cosméticos, sólo se conocen las rutas de biotransformación para unos pocos de ellos. Etilhexil dimetil PABA (EDP), que es uno de los filtros UV más utilizados en los protectores solares por su eficacia protectora, no era uno de ellos. Por lo tanto, se ha estudiado la biotransformación in vitro de EDP a través de incubaciones metabólicas con microsomas de hígado de rata. Se han identificado dos metabolitos de fase I de EDP, el ácido 4-(N, N'-dimetilamino)benzoico (DMP) y el ácido 4-(N-metilamino)benzoico (MMP), mediante análisis basados en la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y la cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS). Para confirmar la ruta de biotransformación in vitro de EDP, se ha desarrollado un método de análisis completamente automatizado basado en SPE-LC-MS/MS en línea para la determinación de EDP, DMP y MMP en orina humana. Sólo se ha hallado DMP y MMP en las muestras de orina, principalmente formando conjugados glucurónidos, los cuáles han sido caracterizados por cromatografía de líquidos con detección basada en la espectrometría de masas con analizadores tipo triple cuadrupolo (LC-QqQ) y cuadrupolo-tiempo de vuelo (LC-QToF). En este contexto, aún no se ha evaluado el potencial de EDP y de sus metabolitos para causar toxicidad reproductiva. Aparte de los estudios necesarios para evaluar la calidad del semen, podría ser de gran interés desarrollar métodos de análisis que permitan determinar EDP y sus metabolitos en semen humano, con el fin de establecer relaciones entre las concentraciones de estas sustancias en semen y los posibles efectos adversos que pueden causar sobre el sistema reproductivo masculino. De esta forma, se ha desarrollado un método de análisis sensible basado en un procedimiento SPE-LC-MS/MS en línea para la determinación de EDP, DMP y MMP en semen humano. Por último, 4-metilbenciliden alcanfor (MBC) es otro de los filtros UV autorizados por la legislación europea cuya ruta de biotransformación es conocida. Así, se ha desarrollado y validado un método de análisis basado en un procedimiento SPE y la detección por LC-MS/MS para la determinación de MBC y su principal metabolito en orina procedente de usuarios de productos cosméticos para la protección solar que contengan MBC.