Estudio del desarrollo de la baya de vid y producción de resveratrol en cultivos celulares mediante las técnicas de proteómica cuantitativa DIGE e iTRAQ

Zusammenfassung

La vid (Vitis vinifera) pertenece a la familia de las Vitaceas y es en términos económicos el cultivo frutícola más importante a nivel mundial, con superficies cultivadas superiores a 7,4 millones de hectáreas (FAO, 2007). De forma aproximada, el 71% de la producción es utilizado en el vino, el 27% como fruto fresco y el 2% como fruto seco. La baya de vid es un fruto no climatérico que presenta una curva de crecimiento doble sigmoidal, que consta de dos fases del crecimiento bien diferenciadas separadas por una fase estacionaria. La fitoalexina producida en la vid es el resveratrol (R). El resveratrol es un compuesto perteneciente a la familia de estilbenos, formado como producto final de la ruta de fenilpropanoides en una rama alternativa a la síntesis de flavonoides por medio de la enzima estilbeno sintasa. El R es un metabolito particularmente interesante por sus probadas propiedades potencialmente beneficiosas para la salud humana por su alta actividad antioxidante, por presentar efectos cardioprotectores, inhibición del crecimiento tumoral en cultivos celulares y algunos modelos animales, entre otras propiedades. Los cultivos celulares de vid son sistemas modelo de reducida complejidad para el estudio de mecanismos de defensa y síntesis de fitoalexinas en respuesta a elicitores. El objetivo general de esta tesis es estudiar los aspectos de la biología de la vid planteados en la introducción mediante la aplicación de las aproximaciones de proteómica cuantitativa libres de hipótesis, DIGE e iTRAQ, así como análisis funcional mediante el software Blast2GO, para caracterizar los procesos biológicos relacionados con la calidad de las bayas de vid y la producción de resveratrol. Los procesos biológicos de interés destacados se tratan en esta tesis en dos partes. La primera parte comprende el estudio del desarrollo de la baya de vid (cv. Muscat Hamburg) con el objetivo específico de la caracterización del proteoma diferencial desregulado durante el desarrollo completo de la baya de vid en los tejidos de mesocarpo y exocarpo para detectar las proteínas, rutas metabólicas y procesos biológicos relevantes para la calidad de la baya de vid en estos tejidos. La segunda parte recoge el estudio de la síntesis de resveratrol como parte de las respuestas de defensa mediante a los cultivos celulares de vid (cv. Gamay) debido a la elicitación con metil jamonato (MeJA) y ciclodextrina dimetilada (MBCD) con el objectivo específico de caracterizar el proteoma diferencial desregulado y perfil de estilbenos en el medio extracelular e intracelular para desvelar un nuevo conocimiento de los procesos del proceso de biosíntesis de resveratrol y su acumulación extracelular y profundizar en otras respuestas de defensa inducidas por la elicitación. En la primera parte de la tesis se muestrean siete estadíos del desarrollo, cuatro pertenecientes a la primera fase del desarrollo: cuajado, 4mm, 7mm, 15mm seleccionados en base al diámetro del fruto y en maduración se recogen tres estadíos, envero (V-100) y dos estadíos seleccionados en base a la densidad del fruto (110 y 140 g/l). Se identifican y cuantifican mediante las técnicas de proteómica cuantitativa DIGE e iTRAQ, 154 y 411 proteínas, respectivamente para la primera fase del desarrollo de la baya de vid en pericarpo y 67 y 613 proteínas, respectivamente para la segunda fase de maduración de la baya en mesocarpo. El análisis en detalle de las proteínas identificadas llevó a detectar con ambas técnicas los mayores cambios del proteoma al final de la primera fase del desarrollo (7mm-15mm) y comienzo de maduración (15mm-V100, V100-110g/l). El análisis iTRAQ ha permitido una cobertura del proteoma diferencial de vid entre 2 y 6 veces superior al análisis mediante la técnica DIGE para el análisis de la primera fase del desarrollo y maduración, respectivamente. Sin embargo, la separación a nivel de proteína y no de péptido mediante DIGE ofrece una información más robusta de la existencia de diferentes isoformas y especies de proteínas, lo que evidencia la complementariedad de ambas estrategias. El análisis de exocarpo llevó a cuantificar 513 proteínas mediante la técnica iTRAQ. Las proteínas identificadas y cuantificadas en ambas fases del desarrollo y en los tejidos de pericarpo, mesocarpo y exocarpo, se analizaron mediante un análisis funcional mediante el software Blast2GO tras la aplicación de un análisis de enriquecimiento de términos GO basado en el test de Fisher que permitió detectar lo términos enriquecidos destacados para cada una de las fases del desarrollo tanto de procesos biológicos, componentes celulares y función molecular. El proteoma diferencial de exocarpo y mesocarpo de la baya aporta una información valiosa en cuanto a procesos determinantes para la calidad del fruto y sus productos derivados, destacando estos procesos: -identificación de parálogos específicos glutatión-S-transferasa (GST-Tau1) con perfiles de acumulación paralelos a la proteína UFGT, lo que sugiere su implicación en el transporte y acumulación de antocianinas en la vacuola. -identificación de proteínas relacionadas con la síntesis de monoterpenos en piel y mesocarpo, proteínas candidatas como posibles biomarcadores del aroma de las bayas de vid específicamente con la variedad cv. Muscat Hamburg. -identificación en exocarpo de proteínas implicadas en la ruta del ácido octadecanoico que indican la síntesis de compuestos aromáticos. -identificación de isoflavona reductasa like-6 validada a nivel de transcrito no caracterizada en vid y posiblemente implicada en la síntesis de fenilpropanoides volátiles relacionados con el desarrollo de aromas. El proteoma diferencial de mesocarpo y exocarpo de la baya de vid aporta una información valiosa en cuanto a procesos determinantes del desarrollo del fruto. Los perfiles de proteínas obtenidos apoyan la formulación de nuevas hipótesis que ayudan a esclarecer las rutas metabólicas que actúan en cada fase del desarrollo del fruto de vid en relación a: metabolismo energético (fotosíntesis, respiración y fermentación), metabolismo de amino ácidos y nitrógeno, metabolismo secundario, transporte, metabolismo de carbohidratos, metabolismo de lípidos, stress y biogénesis de componentes celulares. Cabe destacar por su implicación en el balance azúcar/ácido, la detección de puntos clave para entender el metabolismo de carbohidratos en perocarpo/mesocarpo de los intercambios entre las enzimas siguientes: invertasa ácida vacuolar (INV)/sacarosa sintasa (SuSy), fosfofructoquinasa dependiente de pirofosfato (PFP) y fosfofructoquinasa (PFK-1), así como de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) y malato deshidrogenasa (MDHc). En la segunda parte de la tesis se estudia las respuestas de defensa y producción de resveratrol en cultivos celulares de vid (cv. Gamay) a nivel del proteoma y perfil de estilbenos tras la comparación de los medios extra- e intracelulares tras los tratamientos de elicitación a 96 horas: control, MeJA, MBCD y MBCD+MeJA. En el medio extracelular el proteoma se estudió mediante electroforesis bidimensional convencional detectando 233 spots y seleccionando 39 spots diferenciales. Se identificaron 25 spots codificados por 10 genes diferentes, detectando diferentes isoformas y especies de proteínas diferenciadas por pI y Mw. Las proteínas identificadas se agruparon en peroxidasas, proteínas PR y proteínas apoplásticas. En el medio intracelular, analizado por DIGE, se detectaron 1031 spots, seleccionando como diferenciales 67 e identificando 58 spots y nos centramos en aquellas proteínas con funciones relacionadas con el ciclo de división celular, la producción de resveratrol y proteínas de defensa. El perfil de estilbenos indica que el medio intracelular acumula formas libres y glicosiladas de R mientras que solamente las formas libres se secretan al medio extracelular. En cualquier caso, los niveles de resveratrol aumentan por el tratamiento de elicitación de forma creciente a MeJA, MBCD y MBCD+MeJA, existiendo un efecto sinérgico en la acumulación de R en el tratamiento combinado de ambos elicitores. Aunque en caso del tratamiento con MBCD o MBCD+MeJA, las grandes cantidades de R producidas se acumulan en el medio extracelular. En el control las pequeñas cantidades de R permanecen en el medio intracelular y por tratamiento con MeJA aunque no existe síntesis de novo, sí que hay una translocación de t-R al medio extracelular. Los niveles de piceídas en el medio intracelular no varían prácticamente por la elicitación. En todos los casos los niveles de las formas isoméricas trans- fueron superiores a las formas cis-. Los resultados obtenidos en esta segunda parte de la tesis muestran que la elicitación de cultivos celulares de vid por la acción combinada de ambos elicitores induce la acumulación extracelular de t-R, de isoformas básicas de peroxidasas (Peroxidasa secretora básica Clase III), proteínas PR (NtPR27, quitinasa III, ß-1,3-glucanasa) y refuerzo de las paredes celulares (xiloglucano endotransglicosilasa, subtilisin proteasa, COMT, PCBER), mientras que el efecto aislado de MeJA influye en el proceso de división celular probablemente mediante la reducción de los nivles de SAMSy. El tratamiento con MeJA produce una represión de la acumulación de proteínas de defensa apoplásticas y la acumulación intracelular de una isoformas de PR-10, lo que implicaría un papel alternativo a la defensa de esta proteína. La isoforma de peroxidasa secretora básica clase III inducida por MBCD (CDI-POXIII) y quitinasa III, probablemente relacionadas con SAR apuntan como posibles biomarcadores de respuesta de defensa por su papel predominante en la elicitación con MBCD. La acumulación de GST Clase Tau2 con perfiles de acumulación paralelos a estilbeno sintasa y la acumulación extracelular de t-R sugiere su implicación en un sistema de transporte extracelular de t-R.