Diversificación de la producción de estilbenos en cultivos celulares de vid mediante ingeniería metabólica

Resumen

El auge de la utilización de los cultivos celulares vegetales para la producción de metabolitos secundarios de interés, debido a su importancia biosanitario, farmacológico y/o industrial, esta promoviendo la busqueda de estrategias eficientes para la obtención de altas producciones. En el caso de los cultivos celulares no embriogénicos de vid (Vitis vinifera) la respuesta, ante patógenos y elicitores, es la inducción de la síntesis y acumulación extracelular de estilbenos. Grandes cantidades de trans-resveratrol (t-R) se producen cuando las células se estimulan con ciclodextrinas metiladas (MBCD), solas o combinadas con jasmonato de metilo (MeJA). La obtención de cultivos celulares con mayor capacidad de biosíntesis y acumulación extracelular de resveratrol, o capaces de convertilo en derivados bioactivos naturales ha hecho que se plante la utilización de otras estrategias como la ingeniería metabólica. La aplicación de esta tecnología de transformación genética en cultivos no embriogénicos en general, y en particular, de vid, es limitada. Eficientes métodos de transformación son una prioridad para aplicar con éxito la ingeniería metabólica. En esta tesis, el desarrollo de un método fiable y eficiente, mediado por Agrobacterium, para la transformación de cultivos celulares de vid (Vitis vinifera cv.Monastrell y cv. Gamay) ha sido puesto a punto, obteniéndose líneas celulares transgénicas mantenidas durante más de 15 meses sin perdida de la expresión del gen integrado, y sin efectos perceptibles en el crecimiento celular y en la acumulación extracelular de t-R en comparativa con las líneas no transformadas. Un promedio de la estimación de la eficiencia de transformación obtenida mediante este método ha sido de 20 y 17 callos transformados por gramo de peso fresco en Vitis vinifera cv. Monastrell y cv. Gamay, respectivamente, manteniéndose de 90-95% de los callos obtenidos bajo continua selección. El establecimiento de un método de transformación es el primer paso para mejorar la ruta de biosíntesis de estilbenos, de t-R y derivados de t-R. El t-R tiene una actividad farmacológica demostrada, sin embargo los derivados de t-R como pterostilbeno o piceatanol, presentan mayor biodisponibilidad oral y bioactividad que el t-R, pero son mucho menos abundantes en fuentes naturales. Por lo tanto, para obtener de manera eficiente estos derivados hay una necesidad de desarrollar nuevos sistemas de bioproducción. En este trabajo, se ha diseñado una estrategia combinantoria de la elicitación con MBCD y MeJA, como punto de partida para la obtención de t-R, junto con la expresión constitutiva de resveratrol O-metiltransferasa de vid (VvROMT) o hidroxilasa citocromo P450 humana (HsCYP1B1) para la producción de pterostilbeno y piceatanol, respectivamente, en cultivos transformados. Los cultivos celulares de vid elicitados transformados con el enzima VvROMT produjerón pterostilbeno, el cual fue detectado intra y extracelularmente, en una nivel de microgramos por litro. Los cultivos celulares de vid elicitados transformados con el enzima HsCYP1B1 produjerón alrededor de 20 mg/L de cultivo de piceatanol, mostrando un aumento de siete veces en relación con el cultivo silvestre, y alcanzó una distribución extracelular de hasta el 45% de la producción total. El transporte del t-R tiene una gran relevancia biotecnológica y fisiológica; sin embargo tales vías, en su mayoría, son desconocidas. Un experimento de proteómica diferencial, DIGE, se llevo a cabo para explorar los perfiles de expresión de proteínas biosintéticas de t-R y de otras proteínas que cuya coexpresión mostrarán potenciales proteínas implicadas en dicha respuesta celular. La correlación de glutation-S-transferasas (GSTs) de clase tau con varias isoformas de estilbeno sintasa, fenilalanina amonioliasa y la producción de t-R junto con análisis de qRT-PCR hizo posible el establecimiento de un candidato, GST-2. La expresión constitutiva de GST-2 en cultivos celulares de vid sin elicitar produjo una acumulación extracelular de t-R, sobretodo cuando los medios de cultivo contenían compuestos adsorbentes de t-R como PVP y β-ciclodextrina. Además, la expresión transitoria de GST-2 fusionada con GFP en células de vid mostró una doble localización, membrana plasmática y tonoplasto, proporcionando evidencia adicionales de su implicación en la acumulación extracelular de t-R mediante un mecanismo a través de membranas.