Mecanismos implicados en la separación celular de schizosaccharomyces pombe. Caracterización funcional de proteínas de la familia ghf81

Resumen

La pared celular es una estructura presente en levaduras y otros hongos que rodea completamente a las células sirviéndole de protección. Las enzimas implicadas en la dinámica degradativa del beta-glucano, componente mayoritario de la pared celular, son las beta-glucanasas, que catalizan la hidrólisis del enlace beta-O-glicosídico de la cadena del carbohidrato. La primera parte de la tesis se centró en el estudio estructural de las (1,3)beta-endoglucanasas de la familia GHF81 de la levadura Schizosaccharomyces pombe, SpEng1 y SpEng2, y Saccharomyces cerevisiae ScEng2. Se procedió a purificar estas proteínas y analizar diferentes variables bioquímicas. Mediante HPLC-PED se estudió su mecanismo hidrolítico demostrando su capacidad para degradar como mínimo un laminari-pentasacárido, de manera similar a otros miembros de la familia GHF81. Se identificó el posible dominio catalítico de ScEng2 en su extremo carboxilo, el cual fue purificado posteriormente y analizado. Mediante mutagénesis dirigida se identificaron varios aminoácidos clave en su actividad enzimática. Además, se ha comprobado que SpEng1 posee un dominio de unión a glucanos en su extremo carboxilo; éste fue purificado y se comprobó su especificidad frente a sustratos insolubles con enlace (1,3)beta. Posteriormente, se estudió la implicación de Eng1 y Agn1 ((1,3)alfa-endoglucanasa) en el proceso de separación celular y los mecanismos de transporte y actuación en las zonas donde son requeridas. Comprobamos que Eng1 es necesaria para degradar el septo primario que separa las dos células hijas tras la mitosis, y Agn1 el cilindro de pared que rodea a este septo de separación. Ambas proteínas se localizan en forma de anillo rodeando al septo en células silvestres. El estudio de su localización en mutantes defectivos en separación celular, como los del complejo del exocisto, mid2 y spn , permitió concluir que en S. pombe, el anillo de septinas funcionaría como un marcador.