Determinantes moleculares de la modulación de la apertura y cierre del canal de K+ hERG por dominios citoplásmicos

Resumo

El canal humano hERG pertenece a la familia eag (KCNH) de canales de potasio dependientes de voltaje. Debido a su peculiar comportamiento como "rectificador anómalo", hERG juega un papel crucial en la finalización del potencial de acción ventricular cardíaco, pero también un papel fundamental en la fisiopatología de diversos tipos de células nerviosas, endrocrinas y tumorales. Mientras que los sensores de voltaje y los componentes de la maquinaria de apertura y cierre de los canales de K+ dependientes de voltaje se sitúan en el cuerpo central de la proteína, en los últimos años se ha reconocido que los mecanismos de activación y cierre implican también a los dominios amino y carboxilo terminales. En el caso de hERG la presencia de estos largos dominios es una clave para su normal apertura y cierre y para la modulación de su actividad por estímulos hormonales. Sin embargo, aún se desconoce la contribución relativa de cada dominio citoplásmico a los cambios conformacionales asociados a la apertura y el cierre de este canal. En esta Tesis, nos hemos centrado en el estudio de la arquitectura molecular de los dominios citoplásmicos de hERG mediante FRET, así como en la mejor comprensión de la relevancia de dichos dominios, particularmente del dominio eag en el extremo amino terminal, en los fenómenos de apertura y cierre del canal. En primer lugar, con el fin de confirmar el posicionamiento relativo de proteinas fluorescentes introducidas en distintas posiciones de la secuencia de hERG, hemos desarrollado la combinación TIRF-FRET a fin de obtener datos fluorimétricos correspondientes a canales totalmente funcionales y correctamente ensamblados en la membrana plasmática. Hemos podido validar así los datos obtenidos previamente en nuestro laboratorio a partir de las mediciones de FRET en condiciones de epifluorescencia y con la señal procedente del total de la célula. En segundo lugar, mediante el uso de colorantes (DiBAC4(5) y DPA) que se mueven entre las dos hemicapas de la membrana plasmática en respuesta a cambios de voltaje, hemos estimado las variaciones del nivel de FRET entre dichos colorantes y proteínas fluorescentes introducidas en distintas posiciones del canal hERG. Los resultados obtenidos con la DPA mostraron un mayor nivel de FRET con las construcciones portando la proteína fluorescente en el extremo amino que en el carboxilo, observándose niveles intermedios con los fluoróforos introducidos en otras posiciones de la secuencia del canal. Finalmente, hemos comprobado que un fragmento recombinante correspondiente al dominio eag es capaz de recuperar la funcionalidad de canales que presentan alteraciones estructurales en el extremo amino. Esta recuperación se pierde en presencia de mutaciones puntuales tanto en el lazo S4-S5 como en los primeros residuos del dominio eag. Además, en todos los casos en que se observó recuperación funcional, se observó también un considerable nivel de FRET en condiciones de TIRF entre el fragmento eag recombinante y el canal, mientras que en aquellos casos en los que no se obtuvo recuperación funcional, no se observaron niveles apreciables de FRET.