Estudio cromatografico-fluorimetrico de la degradacion enzimatica de diadenosin polifosfatos en medula adrenal bovina

Resumen

Se han preparado los compuestos fluorescentes di-etenoadenosina polifosfatos, epsilon-(apna) a partir de los precursores diadenosina polifosfatos, apna, por tratamiento con cloroacetaldehido. La hidrolisis enzimatica de los compuestos epsilon-(apna) produce un importante aumento de fluorescencia (ex.305 nm, em.410 nm) que depende del numero de grupos fosfato. Mediante hplc en fase reversa es posible separar todos los compuestos epsilon-(apna) n=2-6 y sus productos de degradacion enzimatica. Los compuestos epsilon-(apna) son excelentes sustratos de los enzimas con actividad dinucleosido polifosfato hidrolasa, especificas e inespecificas, presentes en tejido adrenocromafin. Las celulas cromafines contienen un ectoenzima de baja especificidad y alta afinidad hacia los sustratos epsilon-(apna) n=2-6 y cuyos productos son epsilon-amp y epsilon-ap(n-1); apna y gpng son sustratos alternativos, km 2 microm. El tejido adrenocromafin contiene al menos tres actividades citosolicas capaces de hidrolizar dinucleosido polifosfatos, uno inespecifico y dos de alta especificidad. El enzima inespecifico de masa mayor que 150 kda presenta un patron de corte analogo al del ectoenzima. Los enzimas altamente especificos de 30 y 20 kda respectivamente se corresponden con las actividades dinoclucleosido trifosfato hidrolasa y dinucleosido tetrafosfato hidrolasa y presentan km de 11 microm y 1 microm para los sustratos epsilon-(ap3a) y epsilon-(ap4a) respectivamente. Ambos enzimas especificos son inhibidos por iones zn2+ pero el enzima de 20 kda es fuertemente inhibido por el ion f- y los nucleotidos ap4 (ki=5 nm) epsilon-ap4 y epsilon-ap5.