Development of new methodologies for biomolecules determination based on the use of immunoassays and inductively coupled plasma mass spectrometry detection

Zusammenfassung

La espectrometría de masas con plasma inductivamente acoplado como fuente de ionización (ICP-MS) es una técnica de análisis elemental que permite cuantificar la mayor parte de los elementos de la tabla periódica de forma rápida y a niveles de ultratraza. A lo largo de la última década, y debido a sus características analíticas, el ICP-MS se ha utilizado como sistema de detección en inmunoensayos para la determinación de biomoléculas. A pesar de los avances que se han producido, este tipo de estrategias todavía no están exentas de inconvenientes. Entre los retos que aún están por resolver, se encuentran: (i) desarrollo de métodos para la determinación de haptenos (biomoléculas de bajo peso molecular < 10 kDa); (ii) falta de criterio para seleccionar el tipo de inmunoensayo más adecuado para una aplicación bioanalítica dada, sobre todo cuando se trabaja con haptenos; y (iii) escaso aprovechamiento del potencial del ICP-MS (sensibilidad, límites de detección, capacidad de análisis multielemental, etc.). En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado nuevos métodos de análisis de biomoléculas con detección mediante ICP-MS tratando de solucionar los inconvenientes citados con anterioridad. Los métodos se han aplicado al análisis de toxinas en alimentos y de biomarcadores oncológicos en fluidos biológicos (suero). En primer lugar, debido a la gran preocupación existente por la seguridad alimentaria y el efecto de la alimentación sobre la salud humana, se ha desarrollado un nuevo método para la cuantificación de la aflatoxina M1 (hapteno) en muestras de leche que cumpliera con los niveles de seguridad requeridos por las actuales políticas internacionales. Por otro lado, se han comparado diferentes formatos de inmunoensayos competitivos para la determinación de esta misma aflatoxina en leche. Además, se ha estudiado el efecto de la naturaleza química y del tamaño de las nanopartículas (es decir, Ag/Au, 80 nm/40 nm) empleadas en los inmunoensayos sobre los parámetros analíticos. Finalmente, se presenta un nuevo enfoque con el objeto de aumentar la sensibilidad de los inmunoensayos homogéneos con detección mediante ICP-MS, con la introducción de un alto número de etiquetas por anticuerpo monoclonal mediante el empleo de polímeros como portadores de múltiples iones lantánidos. Esta metodología se ha aplicado a la determinación simultánea de 4 biomarcadores de cáncer (CEA, sErbB2, CA 15.3 y CA 125) en suero humano. Los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral demuestran el enorme potencial que presenta el ICP-MS como técnica de análisis de biomoléculas. La selección adecuada del formato de inmunoensayo y la correcta optimización de las condiciones de trabajo son el punto crítico que determinará los parámetros analíticos del método desarrollado. Así: - Es posible determinar haptenos a niveles de ultratraza (sub-ppt) empleando inmunoensayos competitivos. - En general, para los haptenos, se obtienen mejores resultados analíticos cuando el inmunoensayo competitivo emplea como especie trazadora anticuerpos en lugar del analito conjugado a una proteína portadora. - El empleo de polímeros de lantánidos, como estrategia de marcaje en inmunoensayos en fase homogénea, permite llevar a cabo (mediante la adecuada separación cromatográfica) el análisis multicomponente de biomoléculas mediante ICP-MS con elevada sensibilidad, precisión y exactitud.