Caracterización farmacológica y miolecular del receptor nicotínico para la acelticolina de la célula cromafín bovina

Resum

ÍNDICE INTRODUCCIÓN...................................................................................................................1 1. MARCO EN EL QUE SE DESARROLLA ESTA TESIS ..................................................2 2. LA CÉLULA CROMAFÍN COMO MODELO NEUROSECRETOR ..................................3 2.1. La glándula adrenal..................................................................................................3 2.2. La célula cromafín y otras células de la médula adrenal ..........................................6 2.3. La célula cromafín como modelo de neurona secretora: el término paraneurona.............................................................................................................7 2.4. Funciones fisiológicas de la célula cromafín.............................................................8 3. CANALES IÓNICOS IMPLICADOS EN LA EXCITABILIDAD DE LA CÉLULA CROMAFÍN ....................................................................................................................9 3.1. Canales iónicos activados por voltaje..................................................................... 10 3.2. Canales iónicos activados por ligando ................................................................... 11 3.3. Otros canales......................................................................................................... 13 4. EL PROCESO SECRETOR DE CATECOLAMINAS .................................................... 14 4.1. Acoplamiento excitación-secreción: papel mediador del calcio .............................. 14 4.2. Homeostasis celular del calcio ............................................................................... 16 4.3. La vesícula cromafín .............................................................................................. 17 4.4. El proceso exocitótico ............................................................................................ 17 4.5. El proceso endocitótico .......................................................................................... 18 5. EL RECEPTOR NICOTÍNICO DE TIPO NEURONAL ................................................... 19 5.1. Estructura y composición de los nAChRs neuronales ............................................ 19 5.2. Clasificación de los nAChRs neuronales................................................................ 22 5.3. Aspectos funcionales de los nAChRs neuronales .................................................. 23 5.4. Modulación del nAChR neuronal............................................................................ 25 3 5.5. Farmacología de los nAChRs neuronales .............................................................. 27 5.6. Importancia fisiopatológica de los nAChRs neuronales .......................................... 29 5.7. nAChRs en la célula cromafín bovina..................................................................... 31 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ........................................................................................ 33 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 35 1. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS CROMAFINES BOVINAS.......................... 36 2. CULTIVO DE CÉLULAS PC12 ..................................................................................... 37 3. REGISTRO DE CORRIENTES IÓNICAS MEDIANTE LA TÉCNICA DE PATCHCLAMP ......................................................................................................................... 38 3.1. La técnica de patch-clamp ..................................................................................... 38 3.2. Registro de corrientes nicotínicas en células cromafines bovinas .......................... 40 4. REGISTRO DE CORRIENTES NICOTÍNICAS EN OVOCITOS DE XENOPUS LAEVIS......................................................................................................................... 42 5. MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE Ca2+ CITOSÓLICO EN POBLACIONES CELULARES ................................................................................................................ 44 6. MEDIDA DE LA SECRECIÓN DE CATECOLAMINAS EN POBLACIONES CELULARES ................................................................................................................ 45 7. PURIFICACIÓN E INMUNODETECCIÓN DE RECEPTORES QUE CONTIENEN LA SUBUNIDAD 7 ...................................................................................................... 47 7.1. Purificación de nAChRs que contienen la subunidad 7 mediante inmunoprecipitación ............................................................................................... 47 7.2. Inmunodetección de las subunidades nicotínicas 3 y 7 mediante la técnica de Western blot ...................................................................................................... 49 8. SOLUCIONES Y COMPUESTOS QUÍMICOS UTILIZADOS ........................................ 51 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO............................................................................................. 51 4 RESULTADOS.................................................................................................................... 53 1. EFECTO DE BLOQUEADORES SELECTIVOS 7 SOBRE LAS CORRIENTES INDUCIDAS POR ACh EN RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS ......................... 54 2. EFECTO DEL AGONISTA SELECTIVO 7 PNU-282987 SOBRE RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS ............................................................................................. 57 3. EFECTO DE LA PERFUSIÓN CONTINUA DEL AGONISTA SELECTIVO 7 PNU- 282987 SOBRE LAS CORRIENTES INDUCIDAS POR ACh EN RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS ............................................................................................. 60 4. EFECTO DEL MODULADOR ALOSTÉRICO SELECTIVO 7 PNU-120596 SOBRE RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS....................................................... 62 5. EFECTO DE DIVERSOS LIGANDOS SELECTIVOS 7 SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE Ca2+ CITOSÓLICO EN POBLACIONES CELULARES............ 65 6. EFECTO DE DIVERSOS LIGANDOS SELECTIVOS 7 SOBRE LA SECRECIÓN DE CATECOLAMINAS EN POBLACIONES DE CCB................................................... 72 7. PURIFICACIÓN E INMUNODETECCIÓN DE RECEPTORES QUE CONTIENEN LA SUBUNIDAD 7 ...................................................................................................... 75