Evaluación del potencial sensibilizante del Cr (VI) durante el uso del calzado

Abstract

INTRODUCCIÓN: La seguridad del consumidor es a día de hoy esencial y es por eso que se están desarrollando modelos e investigando diversas metodologías para evaluar cuantitativamente el riesgo que pueda generar cualquier bien de consumo. Desde instituciones públicas a nivel europeo y nacional, miembros de la cadena de valor de los bienes de consumo y los grupos de la sociedad civil piden aunar esfuerzos para asegurar que estas metodologías estén bien definidas, bien entendidas y comúnmente acordadas por toda la comunidad científica. Por lo tanto resulta necesario evaluar posibles riesgos en la exposición a través del uso de cualquier artículo de consumo. Son muchas las sustancias químicas utilizadas en la fabricación de los diferentes materiales que componen un zapato (cuero, cauchos, adhesivos, textiles, etc.), incluidas en los diversos tratamientos orientados a proporcionar cualidades como resistencia, durabilidad, flexibilidad, aspectos estéticos, resistencia antimicrobiana, etc. La inclusión de estas sustancias a muy bajas concentraciones puede resultar inocua para una población saludable. No obstante, su presencia en los materiales destinados a uso en el sector del calzado tras un continuado contacto directo con la piel del pie puede llegar a generar, por un lado, hipersensibilización en el usuario sano y, por otro lado, respuestas alérgicas en los individuos que presenten problemas de dermatitis alérgica de contacto. La elevada humedad y temperatura que se genera en el microclima pie-zapato y el prolongado contacto directo entre la piel y los materiales del calzado, ayudan a la lixiviación de los alérgenos desde los materiales mediante el sudor, llegando incluso a atravesar el calcetín. La alergia de contacto tiene lugar cuando sustancias reactivas y de bajo peso molecular penetran en la piel y activan el sistema inmune. La alergia de contacto consiste en dos fases. Una primera fase, llamada la fase de sensibilización donde los cambios en el sistema inmune son inducidos, la cual no implica síntomas ni reacciones alérgicas. La segunda fase, denominada de elicitación se produce cuando el sistema inmune reacciona a la exposición de suficiente cantidad de alérgeno, desarrollándose los síntomas propios de la dermatitis en forma de eczema, picor, etc. En la mayoría de los casos, el cuero es el material que presenta un contacto más directo y prolongado con la piel del pie ya que forma parte de componentes como empeine, forro y plantilla. Más del 90% del cuero producido a nivel mundial está curtido con sales de cromo (aproximadamente 2 billones de m2) (1-5). Es conocido que la alergia por contacto al cromo es tras la alergia a níquel y cobalto la más común, afectando aproximadamente al 1-3% de la población adulta en Europa (2). La dermatitis de contacto por cromo ya se asoció con piel curtida al cromo y artículos de piel hace algunas décadas (6, 7). Dependiendo del grado de fijación del metal a las fibras de colágeno durante el proceso de curtición, el Cr(III) puede ser extraído durante el uso, Sin embargo, y aunque no se utiliza deliberadamente en el proceso de curtición, la presencia de cromo (VI) en el cuero también es muy habitual, resultando en un riesgo para el consumidor. Aunque existe amplia bibliografía sobre como curtir el cuero para evitar la presencia de cromo (VI). la realidad es que dicha eliminación no se consigue en forma completa en ciertos casos (8, 9). De hecho, según estudios realizados desde el año 2000, en Alemania y Dinamarca se observó que más del 30% de los artículos de cuero ensayados contenían Cr(VI) en concentraciones superiores a 3 mg/kg. En otra investigación posterior, llevada a cabo entre sobre calzado exclusivamente, se encontró que el 44% del calzado analizado presentaba niveles de Cr(VI) entre 3 y 62 ppm. En estos estudios se concluyó que la alergia al cromo está actualmente aumentando debido al contacto con cuero (10-15). El Cr(VI) puede aparecer en el cuero curtido al cromo debido principalmente a tres fuentes: • Contaminación por cromatos presentes en pigmentos. • Oxidación generada por la acción de radicales libres provenientes de algunos engrasantes. • Oxidación del Cr(III) favorecida por las condiciones alcalinas existentes durante el neutralizado o tintura del cuero. En cuanto al potencial sensibilizante del Cr(III), existe una serie de estudios que demuestran su relevancia en cuanto a la alergia del cromo, no obstante las restricciones y la mayoría de literatura científica se centra en la liberación de Cr(VI) sin considerar la de Cr(III). (12, 16, 17). Desde mayo de 2015, el reglamento REACH (Reglamento (UE) nº 301/2014) establece que los artículos que vayan a entrar en contacto directo y prolongado con la piel no deben ser introducidos en el mercado si el cuero contiene concentraciones de cromo iguales o superiores a 3 mg/kg referido a materia seca. Este valor está basado en el límite de cuantificación establecido en la norma EN ISO 17075 para cuero. Según este método, el Cr(VI) es extraído con un tampón fosfato durante 3 horas y tras su reacción con 1,5-difenilcarbazida dando lugar a 1,5-difenilcarbazona que forma un complejo de color violeta con el Cr(VI), se cuantifica fotométricamente a 540 nm (18). Por otro lado, el comité de normalización del cuero (CEN TC/289) desarrolló la norma EN ISO 17072-1 “Determinación del contenido en metales extraíbles en cuero”, en base a la cual se puede cuantificar el cromo total extraíble en condiciones de extracción algo más comparativas con las de uso real del calzado (4 horas, 37°C, solución de sudor artificial a pH 5.5) (19). Según diversos estudios, los umbrales de respuesta alérgicas del Cr(VI) se encuentran entre 1 y 3 ppm (16), lo que implica que materiales de cuero con niveles de Cr(VI) no cuantificables (a concentraciones inferiores a 3 ppm) podrían suponer un riesgo de alergia al Cr(VI) puesto que los umbrales de respuesta alérgica a este compuesto son inferiores al límite de cuantificación. Es por ello que existe una necesidad de validar metodología con menor límite de cuantificación, tal como se propone en este trabajo. Por otro lado, para realizar una evaluación cuantitativa de la exposición al cromo durante el uso de calzado se hace imprescindible conocer la proporción de la sustancia liberada del producto (fenómeno conocido como migración) en sus condiciones de uso, no contempladas en el método EN ISO 17075. En un estudio realizado por Hansen en 2006 (17), se mostró como sujetos alérgicos al cromo con trozos de material de cuero con concentraciones de Cr(VI) inferiores a 3 ppm y hasta valores máximos de 16.9 ppm, que habían sido ocluidos en la espalda durante 48 horas no mostraban alergia. Sin embargo si una muestra de piel con 16.9 ppm de Cr (VI) era llevada como brazalete durante 14 días por estos mismos individuos producía alergia en un 25 % de ellos. La alergia por contacto debida al Cr(VI) presente en el calzado parece ser más frecuente en mujeres que en hombres y esto podría ser debido al hecho de que las mujeres llevan más habitualmente zapatos sin calcetines que los hombres. Otra razón podría ser el hecho de que las mujeres usan zapatos nuevos más a menudo que los hombres y por tanto la exposición al cromo puede ser mayor en las primeras semanas de uso. Esto parece indicar que la migración del alérgeno depende de parámetros como tiempo de exposición, pH, humedad, temperatura, etc. necesarios para promover la extracción del alérgeno desde el material y por tanto que el método de exposición es importante para demostrar el riesgo de alergia por contacto que puede suponer un artículo de uso cotidiano. Por otro lado, el pH de la piel humana se ve afectado por un gran número de factores endógenos como por ejemplo sudor, humedad de la piel, sebo cutáneo, lugar anatómico, predisposición genética y edad. Además factores exógenos como el uso de detergentes, productos cosméticos, oclusión, etc. pueden modificar el pH natural de la piel (20). Un sostenido aumento de pH favorece la degradación de las proteasas y disminuye la actividad de las enzimas que sintetizan los lípidos, alterando la permeabilidad de la barrera epidérmica, con lo que se pueden inducir anormalidades en la integridad/cohesión del estrato córneo y de la homeostasis de la barrera cutánea, influyendo en la patogénesis de enfermedades dermatológicas como el eczema irritativo de contacto, la dermatitis atópica, etc. (21, 22). Así, los efectos de la oclusión, fricción, calor y humedad generados por el uso del calzado, podrían alterar el pH superficial de la piel, llegando a afectarse la función barrera de la piel del pie, y por tanto la homeostasis cutánea, lo que podría por un lado favorecer la penetración de potenciales alérgenos e irritantes procedentes de los materiales de calzado tras un contacto directo y prolongado con el pie y por otro lado favorecer el crecimiento microbiano. Para evaluar la función barrera se utilizan métodos no invasivos como la medición de pH, del contenido en sebo, etc. A día de hoy, en la bibliografía existente no se encuentran estudios que evalúen la influencia de la oclusión durante el uso de calzado sobre la homeostasis cutánea. Además la medida del pH superficial de la piel durante el uso de calzado da idea de la acidez o basicidad del medio en el que se puede dar la liberación de los alérgenos durante el uso del calzado, parámetro muy importante a la hora de evaluar la migración del cromo y los riesgos de éste durante su contacto con la piel en el microclima pie-zapato. Por otro lado para determinar los riesgos de alergia al cromo a los que se enfrenta el usuario de calzado, además de evaluar la migración de esta especie metálica desde el cuero es necesario evaluar el potencial sensibilizante del cromo lixiviado en las condiciones de uso de calzado. Para ello actualmente se están estableciendo métodos in vitro para valorar parámetros asignables a la clasificación de un compuesto o mezcla como sensibilizante dérmico evitando el uso de sujetos de experimentación y de animales, siguiendo las directrices y sugerencias de la Unión Europea y la OCDE (EURL ECVAM Strategy for Replacement of Animal Testing for Skin Sensitisation, Hazard Identification and Classification, JRC (2013); Adverse Outcome Pathway -AOP-, OECD (2012)). Entre otros, están siendo evaluados métodos como el DPRA (Direct Peptide Reactivity Assay) basados en estudiar la reactividad química de moléculas, así como el uso de cultivos in vitro de queratinocitos humanos para valorar su respuesta a sensibilizantes, a través de la valoración de biomarcadores indicativos de la iniciación de respuestas a estrés celular inducido por sensibilizantes, en la línea del KeratinoSens, que evalúa la activación de la ruta Keap1-Nrf2, o del empleo de líneas celulares dendríticas, como es el caso del h-CLAT o del MUSST (23-26). En este sentido y dados los escasos conocimientos científicos respecto a la cuantificación del riesgo de alergia por contacto del cromo durante el uso de calzado, este proyecto tiene como objetivo estudiar la exposición al cromo desde materiales de cuero durante el uso de calzado, valorando la importancia de las condiciones de exposición generadas en el microclima pie-zapato, como oclusión, temperatura, pH, humedad, etc. y su implicación en la migración del cromo así como evaluar el potencial sensibilizante del cromo liberado desde el cuero y dentro del escenario de uso del calzado, con el fin de valorar el riesgo de desarrollo de reacciones alérgicas al que podría enfrentarse el consumidor. DESARROLLO TEÓRICO: El objetivo final que se pretende lograr con este estudio de investigación es, a través de una estrategia integrada y considerando el escenario de uso de calzado de cuero, evaluar el potencial sensibilizante del Cr (VI) mediante ensayos in vitro e in vivo a concentraciones por debajo de la restricción existente y determinar los niveles de exposición reales de Cr (VI), utilizando metodología de nuevo desarrollo, simulando las condiciones generadas en el microclima pie-zapato. Para la consecución de dicho propósito, se han planteado los siguientes objetivos específicos: 1. Estudio de la Influencia de la oclusión por calzado sobre la función barrera de la piel del pie. Se han evaluado posibles variaciones del contenido en sebo y del pH del SC en cuatro zonas del pie (dorso, metatarso, arco y talón), generadas por la oclusión tras el uso continuado del calzado y calcetines en diferentes condiciones de transpirabilidad que pudieran indicar cambios en la función barrera de la piel del pie, y por tanto, pudieran favorecer la penetración de alérgenos. Para ello, se plantearon pruebas de uso de calzado y calcetines con la toma de medidas del sebo cutáneo y pH de la piel del pie antes y después del uso. 2. Evaluación in vivo del potencial sensibilizante del Cr (VI), para el que se contemplan 3 estudios: 1) mediante pruebas epicutáneas en pacientes sensibles al Cr (VI), se ha estudiado el umbral mínimo de Cr (VI) en las condiciones de uso de calzado parcheando matrices de cuero de sudor artificial en concentraciones próximas a la actual restricción según REACH, 2) se ha demostrado de manera clínica cómo la respuesta alérgica por Cr (VI) al contactar con un cuero depende de las condiciones y zonas de exposición mediante parcheo de un mismo cuero en distintas partes del cuerpo (espalda, muñeca y dorso del pie), 3) mediante pruebas de uso con calzado de cuero conteniendo Cr (VI) por debajo de 3 ppm se ha evaluado el posible riesgo de dermatitis alérgica. 3. Evaluación de la exposición a Cr (VI) durante el uso de calzado de cuero: 1) se han establecido las condiciones óptimas del microclima pie-zapato mediante el estudio de su influencia en la liberación del Cr (VI) desde materiales de cuero para evaluar la cinética de migración del Cr (VI) en el escenario de uso de calzado, 2) se ha puesto a punto un método de análisis más sensible (cromatografía de intercambio iónico usando como detector de radiación ultravioleta un detector de diodos array, HPLC-UV) para cuantificar la migración del Cr (VI) en las condiciones de uso del calzado y a niveles por debajo de 3 mg/kg, 3) se ha modelado la cinética de migración del Cr (VI) en las condiciones de uso de calzado, y se han determinado los parámetros que rigen el fenómeno de difusión del Cr (VI), todo ello mediante el análisis de la liberación de Cr (VI) desde un material de cuero en las condiciones del microclima pie-zapato, llevando a cabo extracciones a lo largo de un intervalo de tiempo hasta conseguir el estado estacionario y cuantificando mediante HPLC-UV. 4. Evaluación in vitro del potencial sensibilizante del Cr (VI). Para determinar el potencial sensibilizante del Cr (VI) desde matrices de cuero de sudor artificial, simulando el escenario real por el que el Cr (VI) durante el uso de calzado migra desde el cuero y llegar a ser bioaccesible a la piel de usuario, se pretendió aprovechar el hecho de que el Cr (VI) como sensibilizante activa los diversos mecanismos involucrados en la DAC, siendo esperable que factores como el NO y la IL-18 se vean incrementados tras hacer contactar este sensibilizante con células dérmicas. Así, se plantearon ensayos in vitro para cuantificar los posibles incrementos en la producción de NO en fibroblastos neonatales y en queratinocitos humanos (células HaCaT), y por otro lado, la producción de IL-18 intracelular en células HaCaT, todo ello tras exponer estas células a soluciones de Cr (VI) en sudor artificial y a matrices de cuero en sudor artificial con Cr (VI) durante 24 horas. CONCLUSIÓN: De acuerdo con los objetivos propuestos en este trabajo y en base a los resultados obtenidos, se pueden extraer las siguientes conclusiones generales: 1. Este es el primer estudio que evalúa el efecto directo de la oclusión por calzado y calcetines sobre la fisiología de la piel mediante medición del pH superficial del SC. A partir de los datos de pH obtenidos al inicio de las pruebas de uso, se obtuvo un pH de la piel del pie en el microclima pie-zapato de 5,5-,5,6 y contenidos en sebo de 0-2 µg/cm2. Esta información resulta de gran utilidad para determinar la migración del cromo durante el uso del calzado. Mientras que otras investigaciones estudiaron variaciones de pH por oclusión en otras partes del cuerpo diferentes del pie, demostrando su influencia degenerativa en la función barrera, este estudio concluyó que la oclusión por calzado con y sin calcetines durante 8 horas afecta al pH superficial de la piel del pie, disminuyéndolo, lo que parece indicar que la función barrera no se afecta por las condiciones de oclusión planteadas en este estudio y por tanto, según la teoría la penetración de alérgenos no tendría que verse favorecida durante el uso de calzado en las condiciones de oclusión evaluadas. 2. Mediante pruebas epicutáneas y pruebas de uso se determinó que concentraciones por debajo de 3 mg de Cr (VI)/kg de cuero pueden conllevar un riesgo dermatitis alérgica de contacto, lo que implica la necesidad de validar metodologías analíticas más sensibles que permitan cuantificar, al menos, contenidos de Cr (VI) en cuero inferiores a 3 mg/kg y de revisar la legislación vigente en esta materia, cuya restricción no asegura evitar respuestas alérgicas de contacto por exposición a Cr (VI) desde cuero. La dermatitis alérgica de contacto depende de las condiciones de exposición humedad, temperatura, oclusión, etc. Para determinar el riesgo potencial de un cuero en generar Dermatitis Alérgica de contacto por Cr (VI) durante el consumo de un artículo, se deberían considerar condiciones de exposición estrictas, mediante su inclusión en el análisis del Cr (VI) simulando así la exposición real. El parcheo ordinario de materiales de cuero, durante 48 horas, que se realiza en Servicios de Dermatología para confirmar si un cuero es el causante de alergia por Cr (VI) podría provocar falsos negativos. 3. La migración de Cr (VI) y Cr(III) desde cuero se vio muy influenciada por el efecto del pH, y a su vez por el nivel de pH. En menor medida, pero de manera significativa, la liberación de cromo total también estaba influenciada por el tiempo y la temperatura. Sin embargo, en la migración de Cr (VI), el tiempo en un intervalo de 3-5 horas no fue un factor que influyera significativamente, aunque dependiendo de la matriz del cuero las interacciones del pH con la temperatura y el tiempo podrían influir con carácter significativo en la migración de Cr (VI). La solución de sudor artificial a pH 6,5, de referencia en la norma sobre liberación de níquel en piezas metálicas, debido a su propia composición y no a su valor de pH presenta un elevado potencial de extracción frente a cromo total pero la liberación es mínima con respecto al Cr (VI) comparando con soluciones de sudor artificial a pH 5,5 y 8 de diferente composición. Las diferencias de liberación de Cr (VI) en solución de sudor de igual composición (según norma sobre solidez al color) pero diferente pH (5-8,5) no son significativas. 4. A priori, las condiciones de liberación de Cr (VI) más óptimas para simular las condiciones del microclima pie-zapato y poder así evaluar la cinética de migración de un cuero en las condiciones de uso de un calzado podrían ser: solución de sudor artificial a pH 5,5 de composición, 5 g/l de cloruro sódico, 0,5 g/l de L-Histidina, 2,2 g/l de dihidrógeno fosfato sódico dihidrato, y temperatura de 37 °C, si se utilizase el método colorimétrico para la cuantificación de Cr (VI). Sin embargo, dada la necesidad de poder evaluar contenidos de Cr (VI) por debajo del MET10% (1 ppm), se validó como técnica de análisis la cromatografía por HPLC-UV con columna de intercambio iónico para cuantificar la migración de Cr (VI) descartando como simulante de sudor humano la solución de sudor artificial y usando como sustituto tampón fosfato pH 5,5, y llevando a pH 8 los extractos y patrones antes de análisis para una adecuada respuesta analítica de Cr (VI). 5. La liberación de Cr (VI) en tampón fosfato a pH 5,5 es bastante rápida ya que a tiempos cortos de 2 horas ya se ha liberado prácticamente el 90% del Cr (VI) libre presente en el cuero, considerando que a las 5 horas se alcanza el estado estacionario, por lo que determinar la migración de Cr (VI) de un cuero al contactar con una solución tampón fosfato pH 5,5 durante 5 horas podría dar una medida muy válida del potencial de exposición a Cr (VI) desde un cuero durante el uso de calzado. La cinética de migración del Cr (VI) desde un cuero en las condiciones de uso de calzado se ajusta a un comportamiento Fickiano con coeficientes de difusión entre 5,17-8,89•10-7 cm/s2. 6. La viabilidad celular en células HaCaT y fibroblastos con respecto a la concentración de estimulación de soluciones de Cr (VI) en sudor artificial presentó comportamientos distintos. Sin embargo, para ambas líneas celulares el daño celular aumentó con la concentración de Cr (VI) a niveles por debajo de los 3 µg/ml. La IC20 de Cr (VI) en sudor artificial para queratinocitos HaCaT fue superior a la de fibroblastos, quedando establecidas en 0,47 y 0,43 µg/ml respectivamente. Mediante marcaje fluorescente con ioduro de propidio se concluyó que el daño celular en HaCaT es mayor estimulando con extracto a 0,47 ppm de Cr (VI) que estimulando con Cr (VI) en sudor artificial a igual concentración. 7. El Cr (VI) en sudor y en matrices de cuero no pareció inducir la expresión de alguna isoforma del NO, y por tanto la producción de NO, en fibroblastos tras la exposición durante 24 horas. En células HaCaT, los patrones de Cr (VI) en sudor no produjo un incremento en la producción de NO con respecto a la basal. No obstante, los extractos a la IC20 y concentraciones superiores sí indujeron la producción de NO, debido posiblemente a que el Cr (VI) vio incrementado su efecto en la producción de NO por efecto de la matriz del material de cuero. A elevadas concentraciones de Cr (VI) la viabilidad celular fue tan baja que la concentración de IL-18 intracelular no se detectó. La estimulación de HaCaT durante 24 horas con solución de Cr (VI) en sudor a la IC20 no generó sobreexpresión de IL-18 intracelular. En cambio, un extracto de cuero a igual concentración sí aumentó la concentración de IL-18 intracelular de manera significativa con respecto a la basal, lo que podría implicar que el Cr (VI) por efecto del extracto activa mecanismos involucrados en la dermatitis alérgica de contacto y por tanto se le podría considerar un sensibilizante, dado que su índice de estimulación es superior a 1,2. En células HaCaT, las diferencias en la producción de IL-18 y NO inducida por Cr (VI) a la IC20 entre sudor y matrices de cuero en sudor subrayan la importancia de considerar la matriz a través de la cual el Cr (VI) llega a ser bioaccesible a la piel del usuario durante el uso de calzado. Por todo ello y como conclusión general de este trabajo de investigación, se establece que para proteger al consumidor frente a la exposición a Cr (VI) durante el uso de calzado de piel sería necesario revisar la restricción actual sobre el contenido de Cr (VI) en cuero por no proteger al consumidor lo suficientemente en cuanto a dermatitis alérgica de contacto, y las metodologías implicadas en la evaluación del riesgo de exposición a Cr (VI) a nivel de ensayos in vivo, in vitro o in chemico desde un artículo de consumo como el calzado deberían simular las condiciones de exposición además de considerar la matriz del material a través del cual el Cr (VI) es biodisponible a la piel.